孫成相 丁志海

1天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院普外科 300480；2天津市海濱人民醫(yī)院普外科 300280

0 引言

2018年的全球腫瘤統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，胃癌的死亡率逐漸上升，在腫瘤相關(guān)死亡率中位居第2[1]。精準(zhǔn)的腫瘤分期和預(yù)后判斷是腫瘤精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)制定的TNM（tumor-lymph nodemetastasis）分期系統(tǒng)已在多種腫瘤分期中運(yùn)用，為腫瘤的治療做出了重大貢獻(xiàn)。隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步和治療手段的豐富，胃癌的TNM分期系統(tǒng)也在不斷更新。外科手術(shù)是治療局限性胃癌的主要方法，但即使在根治性切除后仍然可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。眾多的圍手術(shù)期和輔助化療方案的應(yīng)用，已經(jīng)使胃癌患者的生存期大大延長(zhǎng)。實(shí)際上，包括一些臨床驗(yàn)證的生物標(biāo)志物在內(nèi)的臨床病理特征也應(yīng)該考慮在治療決策中，來提供更好的預(yù)后分析和精準(zhǔn)的抗腫瘤策略。為了開展更加精準(zhǔn)的治療和預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，臨床需要更加詳細(xì)和準(zhǔn)確的策略[2-3]。

脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（poliovirus receptor，PVR）,又稱為CD155、Necl5或Tage4，位于人類19號(hào)染色體，有多種剪切變異體，其中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本由417個(gè)氨基酸組成。該基因編碼的蛋白質(zhì)隸屬于免疫球蛋白超家族中的跨膜糖蛋白。其細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的連接，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域主要與動(dòng)力蛋白的輕鏈DYNLT1相互作用[4-5]。PVR在靈長(zhǎng)類譜系中特異性表達(dá)，并且作為脊髓灰質(zhì)炎病毒感染人體細(xì)胞的受體而備受關(guān)注[6]。對(duì)人體組織中的RNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，PVR的mRNA在人體的多種組織和器官中表達(dá)，以腎上腺，肺和胎盤中表達(dá)量最高。近年來的研究結(jié)果表明，PVR在腫瘤的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要作用[7-9]。本研究中探究PVR與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年1月至2016年12月在天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院和天津海濱人民醫(yī)院接受胃切除術(shù)的胃癌患者73例。其中，男性44例，女性22例，年齡（45.6±4.73）歲。收集患者的胃癌組織與癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本，并收集患者的相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤級(jí)別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和3年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后經(jīng)病理診斷明確為胃腺癌；無其他惡性腫瘤；在就診醫(yī)院接受胃切除術(shù)；年齡大于18歲；具有完整的病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過輔助化療；就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究涉及的所有患者資料及標(biāo)本采集工作均得到了患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

PVR抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒（英國(guó)Abcam公司），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）。BX51體視顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

石蠟標(biāo)本由病理科按照常規(guī)方法制作并保存。按4μm的厚度切片，然后附著于防脫玻片上，在60℃的烘箱內(nèi)烘烤2 h。將玻片從烘箱取出后立即置于二甲苯溶液中浸泡15 min（2次），期間晃動(dòng)玻片數(shù)次以充分溶解石蠟。抖去多余液體后，對(duì)玻片進(jìn)行梯度乙醇溶液脫水：無水乙醇浸泡5 min；無水乙醇浸泡5 min；95%乙醇浸泡5 min；75%乙醇浸泡5 min。脫水后，將玻片放置于流動(dòng)的自來水中沖洗5 min。之后，將玻片浸入pH為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，再放置于微波爐內(nèi)使液體沸騰10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。之后，等待溶液自然冷卻至室溫，再加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min。將玻片在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中沖洗3次，每次5 min。滴加山羊血清，室溫孵育15 min，封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。棄去血清后直接滴加經(jīng)抗原稀釋液稀釋后的一抗（1∶100），置于濕盒內(nèi)，置于4℃環(huán)境中孵育過夜。用PBS清洗后，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育15 min。用PBS清洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min。用PBS洗凈后，滴加二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色液，每個(gè)玻片均顯色2 min。用流動(dòng)自來水沖洗玻片5 min后，用蘇木素染料染色3 min，再用鹽酸乙醇溶液分化，直至氨水返藍(lán)。將玻片依次放入75%乙醇，95%乙醇，無水乙醇中各脫水2 min，再放于二甲苯中透明處理10 min。最后用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

根據(jù)免疫組織化學(xué)染色試劑盒的說明書對(duì)組織標(biāo)本切片進(jìn)行免疫組化染色。PVR的表達(dá)量由2名獨(dú)立的病理醫(yī)師根據(jù)免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行判斷。顯微鏡觀察時(shí)，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，依照陽性細(xì)胞比例和和陽性染色強(qiáng)度2個(gè)指標(biāo)評(píng)定組織切片中PVR的染色水平。陽性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)為0%時(shí)，記為0分，1%～29%時(shí)，記1分，30%～60%，記2分，＞60%時(shí)，記3分。陽性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無染色記0分；弱染色記1分；中度染色記2分；高度染色記3分。以陽性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積判斷表達(dá)情況，其中結(jié)果≥6分為高表達(dá)組，結(jié)果＜6分為低高表達(dá)組。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用R語言，根據(jù)腫瘤基因組圖譜（thecancer genome atlas，TCGA）中的胃癌患者數(shù)據(jù)繪制PVR基因表達(dá)箱式圖。使用R語言中的RTCGA包和RTCGA.mRNA包獲取各個(gè)樣本中的PVR表達(dá)數(shù)據(jù)，使用dplyr包對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用ggplot2包和ggsignif包進(jìn)行基因表達(dá)箱式圖的繪制和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=PVR）和癌癥基因組圖集（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析。總生存期（overall survival，OS）定義為從隨機(jī)化分組開始到任何原因引起患者死亡的時(shí)間；無病生存期（disease-free survival，DFS）定義為從隨機(jī)分組開始到疾病復(fù)發(fā)或者由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行曲線繪制，以基因表達(dá)中位數(shù)來劃分高表達(dá)和低表達(dá)，用虛線標(biāo)記95%置信區(qū)間，并顯示風(fēng)險(xiǎn)比（hazards ratio，HR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。PVR高表達(dá)和低表達(dá)患者的總生存期和無病生存期比較采用時(shí)序檢驗(yàn)（Logrank）方法；比較患者PVR表達(dá)量和病理信息相關(guān)性時(shí)，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVR在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌隊(duì)列，分析PVR mRNA在胃癌組織中的表達(dá)情況，共納入了408例胃癌標(biāo)本和211例癌旁正常組織標(biāo)本。如圖1所示，PVR mRNA在胃癌標(biāo)本中明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)而使用GEPIA分析了胃癌患者PVR表達(dá)量與患者預(yù)后之間的關(guān)系。由Kaplan-Meier生存曲線可知，PVR表達(dá)量較高的患者中，總生存率（P=0.011）和無病生存率（P=0.032）均較低（圖2A和2B）。上述結(jié)果提示，PVR在胃癌組織中的表達(dá)水平較高，且PVR的表達(dá)與胃癌患者的生存期相關(guān)。

圖1 胃癌組織中脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）的mRNA表達(dá)情況

圖2 脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）的表達(dá)與胃癌患者生存期的相關(guān)性

2.2 PVR在胃癌組織中的表達(dá)

為了進(jìn)一步探究PVR在胃癌進(jìn)展中的作用。本研究中，運(yùn)用免疫組化染色法檢測(cè)73例胃癌組織中PVR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PVR主要表達(dá)在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，在間質(zhì)中不表達(dá)，而PVR在癌旁正常組織中基本不表達(dá)。

根據(jù)染色強(qiáng)度，將胃癌患者分為PVR高表達(dá)組和PVR低表達(dá)組（圖3A）。比較后發(fā)現(xiàn)，PVR在癌旁正常組織中的表達(dá)量顯著降低（圖3B）。上述結(jié)果提示，PVR在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

圖3 胃癌組織和癌旁正常組織中脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）的免疫組化染色結(jié)果

2.3 PVR表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明PVR在胃癌進(jìn)展中的作用，分析比較了PVR高表達(dá)組和PVR低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤級(jí)別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤復(fù)發(fā)情況。PVR高表達(dá)組和PVR低表達(dá)組患者在性別和年齡上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），保證了兩組具有可比性。分析結(jié)果顯示，PVR表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大小（P=0.001）和3年內(nèi)復(fù)發(fā)情況（P=0.013）的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與腫瘤級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（表1）

表1 脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析（例）

3 討論與結(jié)論

PVR最初被重視是因?yàn)槠浣閷?dǎo)了脊髓灰質(zhì)炎病毒感染人體細(xì)胞。近些年的大量研究結(jié)果表明，PVR不僅與病毒感染有關(guān)，而且與腫瘤的增值侵襲和免疫系統(tǒng)等也有緊密的聯(lián)系。

本研究中通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PVR mRNA在胃癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。進(jìn)而使用免疫組化染色法分析了PVR在73例胃癌患者組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明PVR蛋白在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，而在癌旁正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，PVR在人類的多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。有研究者利用免疫組化法分析了134例胰腺癌組織中PVR的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PVR在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與預(yù)后、腫瘤免疫力和血管生成有關(guān)。本研究中，通過生存分析得知，PVR mRNA的表達(dá)量與胃癌患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)。對(duì)73例胃癌患者臨床資料的回顧性分析結(jié)果也表明，PVR表達(dá)量越高，患者腫瘤體積越大且更容易復(fù)發(fā)。此外。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，PVR的表達(dá)情況與肺腺癌、軟組織肉瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌等多種癌癥的預(yù)后相關(guān)[10-15]。

迄今為止，研究者尚未完全闡明PVR在人類生理和病理中的確切作用。特別是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，PVR的功能在很大程度上都是不清楚的。在免疫學(xué)功能上，先前的研究結(jié)果表明，PVR既可以發(fā)揮抑制作用，同時(shí)也具有刺激和激活免疫的作用。PVR與DNAM-1相互作用刺激體內(nèi)的免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用[16]。然而，最近的幾項(xiàng)研究結(jié)果表明，TIGIT結(jié)合PVR并抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞因子的分泌，如干擾素γ，腫瘤壞死因子α[17-21]。在轉(zhuǎn)化的早期階段，腫瘤細(xì)胞上PVR的表達(dá)主要促進(jìn)抗腫瘤免疫功能，而在晚期則支持腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸。

在惡性轉(zhuǎn)化的信號(hào)中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體或致癌性Ras突變的刺激激活了Ras-Raf-MEKERK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄程序，最終導(dǎo)致CD155轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)[22]。在Ras突變的細(xì)胞中，CD155的過表達(dá)影響了細(xì)胞的G0/G1期，并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖[23]。盡管尚未確定所涉及的信號(hào)傳導(dǎo)分子，但CD155誘導(dǎo)的增殖信號(hào)需要胞質(zhì)ITIM的參與，這表明該功能僅對(duì)CD155α亞型有效。CD155介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)還可以與生長(zhǎng)因子信號(hào)協(xié)同作用，以控制腫瘤的生長(zhǎng)。例如，在NIH3T3細(xì)胞中，CD155增強(qiáng)了血小板衍生的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)了Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路[24]。另外有研究者報(bào)道，CD155的抑制通過影響B(tài)ax和Bcl-2表達(dá)之間的比例來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。

血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中也起到了關(guān)鍵作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)血管的生成[26-27]。有研究結(jié)果表明，PVR與VEGF受體2相互作用并調(diào)節(jié)VEGF誘導(dǎo)的血管生成[28]。針對(duì)胰腺癌的多項(xiàng)研究結(jié)果表明，PVR與血管生成和患者預(yù)后密切相關(guān)[28-30]。另外，PVR的體外阻斷不影響胰腺癌細(xì)胞系的VEGF的表達(dá)，腫瘤中的PVR可能通過VEGF的受體與其他分子的相互作用來調(diào)節(jié)血管生成，而不是直接與VEGF本身相互作用[28]。靶向VEGF的療法是治療幾種人類惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)療法，因此PVR和VEGF的聯(lián)合治療可對(duì)腫瘤發(fā)揮協(xié)同治療作用。

PVR與細(xì)胞周期和增值具有密切關(guān)系[23-24]。Nishiwada等[13]利用siRNA干擾技術(shù)在人胰腺癌細(xì)胞系中沉默了PVR，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的增值受到明顯抑制，細(xì)胞阻滯在G2/M期。此外，沉默PVR對(duì)ERK、JNK和P38介導(dǎo)的MAPK通路也產(chǎn)生顯著影響[23-24,31]。

綜上所述，PVR在胃癌組織中過表達(dá)，高表達(dá)PVR的胃癌患者預(yù)后更差。因此，PVR水平對(duì)于胃癌患者的預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。本研究可為研發(fā)針對(duì)胃癌的PVR靶向療法提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突