趙慶輝 白志慧 賈文文 湯紅明 劉中民

同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)基地，國家干細胞轉(zhuǎn)化資源庫，上海干細胞臨床轉(zhuǎn)化研究院，上海市干細胞臨床診療工程研究中心，上海 200123

0 引 言

干細胞療法正在突破傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，對于一些人類重大難治性疾病[1-2]的治療表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，近年來已受到全球范圍內(nèi)關(guān)注，成為國際前沿戰(zhàn)略性研究領(lǐng)域。

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）是一類存在于新生兒臍帶組織中的具有較高分化潛能的多能干細胞[3]。在一定條件下，hUC-MSCs可分化成多種功能組織和器官。因具有多向分化潛能、低免疫原性和黏附特性[4-7]以及材料來源豐富和較少倫理學(xué)爭議，hUC-MSCs逐漸成為再生醫(yī)學(xué)療法和組織工程移植的理想種子細胞之一[8-9]，越來越受到研究者的青睞。

截至2020年12月20日，以“hUC-MSCs”為關(guān)鍵詞，在全球最大的臨床試驗數(shù)據(jù)庫ClinicalTrials.gov網(wǎng)站檢索，結(jié)果顯示全球約有275項關(guān)于hUCMSCs移植治療相關(guān)疾病的臨床試驗。在國家衛(wèi)生健康委員會和國家食品藥品監(jiān)督管理總局備案的100項干細胞臨床研究項目中，選擇hUC-MSCs作為干細胞制劑的有45項，占比達45%，治療的適應(yīng)證包括新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）、心血管疾病、糖尿病、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病等人類重大疾病。2008至2019年期間，在中國臨床試驗注冊中心注冊的354項干細胞相關(guān)臨床試驗中，選擇hUC-MSCs作為干細胞制劑的有56項，占比達16%。鑒于此，建立臨床級hUC-MSCs（可達到用于臨床的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）資源庫尤為關(guān)鍵，其不僅可為干細胞臨床研究和應(yīng)用服務(wù)，也可為高校、科研院所、企事業(yè)單位等提供滿足科學(xué)研究所需的干細胞資源[10]。

作為國家干細胞轉(zhuǎn)化資源庫承建單位，同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院早在2017年便啟動了臨床級hUCMSCs的制備和建庫工作。本研究旨在通過分離、培養(yǎng)、擴增、傳代、凍存等操作流程，并對hUC-MSCs進行生物學(xué)特性、安全性與穩(wěn)定性等質(zhì)量檢測，建立臨床級hUC-MSCs資源庫三級庫，以期為科學(xué)研究、臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用以及國家應(yīng)急等提供資源保障和支撐[11]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

質(zhì)量濃度為9 g/L的NaCl溶液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），凍存液（加拿大Stemcell公司），α-MEM培養(yǎng)基、臺盼藍染色液、MesenCultTM成脂分化培養(yǎng)基、MSCgoTM成骨誘導(dǎo)分化試劑、StemPro成軟骨分化試劑盒（美國Gibco公司），UltraGROTMAdvanced完全培養(yǎng)基（美國Helios公司），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司），MSC Phenotyping Kit（間充質(zhì)干細胞表型檢測試劑盒，上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司），GoTaq qPCR Master Mix（支原體熒光定量PCR檢測試劑盒，美國Promega公司），茜素紅、阿利新藍、油紅O（賽業(yè)生物科技有限公司），基質(zhì)膠（美國BD公司），CCK-8試劑盒（美國MCE公司）。

雄性非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（nonobese diabetes/serve combined immunodeficiency,NOD/SCID）小鼠6只，無特定病原體級，5～8周齡，體質(zhì)量約15 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)條件為溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，每周更換2次墊料，飼養(yǎng)環(huán)境干凈整潔。本研究的動物實驗已通過同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心審查。

人臍帶組織來源于同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院產(chǎn)科，要求捐贈者身體健康，無系統(tǒng)性疾病及其他遺傳性疾病，相關(guān)病原學(xué)檢查結(jié)果均為陰性，合格者納入。目前本研究共納入捐贈者247例（計劃500例）。臍帶組織采集前，捐贈者均簽署知情同意書，并統(tǒng)一編碼，保護捐贈者個人隱私。采集完成后，將臍帶組織浸入質(zhì)量濃度為9 g/L的NaCl溶液中，并低溫運輸至藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）實驗室。本研究已通過同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院倫理委員會審查，倫理批件號為[2017]體臨審第（001）號修正1。

1374生物安全柜、371細胞培養(yǎng)箱、7500 Fast熒光定量PCR儀（美國Thermo公司），TS100倒置顯微鏡（日本尼康公司），IC1000細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司），Bact Alter梅里埃微生物培養(yǎng)系統(tǒng)（法國梅里埃公司），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司），DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs建庫流程

按照《中華人民共和國藥典》及干細胞相關(guān)規(guī)范和指南等，結(jié)合hUC-MSCs特性，依次建立種子細胞庫（選取P1代細胞）、主細胞庫（選取P3代細胞）和工作細胞庫（選取P5代細胞），并進行相關(guān)質(zhì)量檢測（圖1）。

圖1 hUC-MSCs建庫流程

1.2.2 hUC-MSCs種子細胞庫的建立

沖洗采集的人臍帶組織，將其剪成1～2 cm小段，并剔除其中的3根血管（2根動脈和1根靜脈）。將剔除血管的臍帶剪成1～2 mm3的組織塊，采用無血清培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)。經(jīng)消化后獲得P0代細胞，再進行傳代、擴增獲得P1代細胞，放行檢驗合格后即為hUC-MSCs種子細胞。

1.2.3 hUC-MSCs主細胞庫的建立

對P1代種子細胞進行逐級傳代、擴增，獲得P3代細胞，放行檢驗合格后形成hUC-MSCs主細胞庫。

1.2.4 hUC-MSCs工作細胞庫的建立

對P3代細胞再次進行傳代、培養(yǎng)、擴增，獲得P5代細胞，放行檢驗合格后形成hUC-MSCs工作細胞庫。

1.2.5 hUC-MSCs質(zhì)量檢測

根據(jù)國家衛(wèi)生計生委與國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》、國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》以及行業(yè)協(xié)會發(fā)布的《干細胞制劑制備與質(zhì)檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（試行）》《干細胞通用要求》等相關(guān)質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范要求，按照相關(guān)檢測方法[11-13]，對建庫的hUC-MSCs進行生物學(xué)特性、安全性與穩(wěn)定性等檢測，內(nèi)容包括但不限于細胞鑒定、存活率及生長活性檢測、純度和均一性檢測、細胞內(nèi)外源致病因子檢測、無菌和支原體檢測、內(nèi)毒素檢測、成瘤性檢測、生物學(xué)效力檢測、異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測等，以確保hUC-MSCs細胞株質(zhì)量可控。

（一）細胞鑒定

采用顯微鏡觀察不同代次細胞的狀態(tài)并拍照。

（二）細胞存活率檢測

將質(zhì)量濃度為40 g/L的臺盼藍染色液與細胞懸液混合，采用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，并計算細胞存活率。

（三）細胞純度和均一性檢測

將P5代細胞懸液以2.5×105個/管均分至EP管中，單染抗體CD11、CD19、CD34、CD45、人類白細胞抗原DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）各取5μl，CD73、CD90、CD105各取1.25μl加入對應(yīng)的EP管中進行染色，棄上清，杜氏磷酸鹽緩沖液重懸后轉(zhuǎn)移至流式管中，最后采用流式細胞儀進行檢測。

（四）細胞內(nèi)外源致病因子檢測

采用定量PCR方法檢測細胞培養(yǎng)上清中是否含有細胞內(nèi)外源致病因子，具體操作參見文獻[12]。

（五）無菌和支原體檢測

取適量P1、P3、P5代細胞培養(yǎng)上清，分別加入需氧培養(yǎng)瓶和厭氧培養(yǎng)瓶中，再置于全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，37℃培養(yǎng)5 d。

取適量P1、P3、P5代細胞培養(yǎng)上清，采用支原體熒光定量PCR檢測試劑盒檢測支原體，具體操作按試劑盒說明書進行。

（六）內(nèi)毒素檢測

取適量P1、P3、P5代細胞培養(yǎng)上清，采用鱟試劑（凝膠法）檢測內(nèi)毒素，具體操作按試劑盒說明書進行。

（七）成瘤性檢測

將P5代細胞懸液加入EP管中，再加入100μl基質(zhì)膠混勻，置于4℃冰盒待用。5～8周齡NOD/SCID雄鼠，稱質(zhì)量分為2組，每組3只。剃除小鼠背部被毛，用預(yù)冷的胰島素針在其中一組小鼠背部兩點進行皮下注射HeLa細胞（每點2×106個），另一組小鼠皮下注射樣本細胞（每點2×106個）。2個月后觀察小鼠注射部位是否有成瘤組織。（八）生物學(xué)效力檢測

按相應(yīng)的試劑盒說明書對P5代細胞進行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化21 d，再分別用茜素紅、油紅O、阿利新藍進行成骨、成脂、成軟骨染色觀察。（九）異常免疫學(xué)反應(yīng)

將P5代細胞與淋巴細胞按照細胞數(shù)量1∶5共培養(yǎng)7 d，然后采用CCK-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖情況。

2 結(jié)果

本研究共分離制備出247株hUC-MSCs。以其中一根臍帶制備的hUC-MSCs（編號ZB09AH）結(jié)果為例，本研究制備的hUC-MSCs具有以下特性。

2.1 細胞鑒定

顯微鏡下觀察可見，不同代次（P1、P3、P5代）的hUC-MSCs均呈梭形，生長良好，詳見圖2。

圖2 顯微鏡觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞（編號ZB09AH）的細胞形態(tài)（×40）

2.2 細胞存活率檢測

臺盼藍染色結(jié)果顯示，hUC-MSCs的細胞存活率＞95%。

2.3 細胞純度和均一性檢測

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖3，CD73、CD90、CD105陽性細胞比例均＞95%，CD11、CD19、CD34、CD45、HLA-DR陽性細胞比例均＜2%，表明制備的hUC-MSCs的純度和均一性良好。

圖3 流式細胞術(shù)檢測hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞表面標(biāo)志

2.4 細胞內(nèi)外源致病因子檢測

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，細胞內(nèi)外源致病因子乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒均為陰性表達。

2.5 內(nèi)毒素檢測

鱟試劑（凝膠法）檢測結(jié)果顯示，內(nèi)毒素含量≤0.5 EU/ml。

2.6 無菌和支原體檢測

分別采用全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)和熒光定量PCR技術(shù)進行無菌和支原體檢測，結(jié)果均為陰性。

2.7 成瘤性檢測

NOD/SCID小鼠皮下注射hUC-MSCs不成瘤，詳見圖4。

圖4 非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠成瘤結(jié)果

2.8 生物學(xué)效力檢測

染色結(jié)果顯示，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，hUCMSCs具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力（圖5）。

圖5 hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞的成骨、成脂、成軟骨分化結(jié)果

2.9 異常免疫學(xué)反應(yīng)

hUC-MSCs（編號ZB09AH）P5代細胞與淋巴細胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，ZB09AH P5代細胞對免疫細胞增殖抑制率為76%，表明ZB09AH P5代細胞具有抑制免疫細胞增殖的能力。

3 討論與結(jié)論

本研究通過分離、培養(yǎng)、傳代、擴增、凍存及質(zhì)量檢測等一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，制備了247株hUC-MSCs細胞株（細胞數(shù)量規(guī)模近1萬份，后期可根據(jù)研究需求規(guī)模化擴增），建立了hUC-MSCs資源庫三級庫，即種子細胞庫、主細胞庫和工作細胞庫。三級庫中細胞數(shù)量分別為1×106個/管（凍存管規(guī)格為2 ml）、5×106個/管（凍存管規(guī)格為2 ml）和5×107個/袋（血袋規(guī)格為10 ml），并存儲于高效氣相液氮罐中。

本研究所用工藝制備的hUC-MSCs通過了中國食品藥品鑒定研究院質(zhì)量復(fù)核檢驗（報告編號為SH201903852和SH201903853），達到了質(zhì)量控制相關(guān)規(guī)定要求。同時已按照相關(guān)流程納入國家干細胞轉(zhuǎn)化資源庫，并在國家科技資源共享服務(wù)平臺共享，為干細胞相關(guān)科技創(chuàng)新活動提供了資源。

質(zhì)量檢測合格的P5代細胞可用于臨床研究，使用前應(yīng)對細胞制劑進行放行檢驗，包括但不限于無菌和支原體檢測、內(nèi)毒素檢測等，檢測合格后方能使用。為保證臨床研究中干細胞制劑可溯源，本研究記錄了細胞流轉(zhuǎn)相關(guān)信息，包括捐贈者信息、樣本采集信息、細胞制備信息、細胞檢測信息、細胞入庫和出庫信息等。

目前，hUC-MSCs資源庫支撐1項科技部應(yīng)對新冠肺炎應(yīng)急攻關(guān)項目“應(yīng)對新冠肺炎的間充質(zhì)干細胞治療研究”（入組37例受試者，無1例不良反應(yīng)）和2項國家干細胞臨床研究備案項目（“人臍帶間充質(zhì)干細胞治療心衰的臨床研究”和“臍帶間充質(zhì)干細胞治療2型糖尿病腎病的多中心臨床研究”），為臨床研究提供了hUC-MSCs資源及技術(shù)保障，并取得了初步進展。其中在應(yīng)對新冠肺炎的干細胞臨床研究中，hUC-MSCs因具有重要的免疫調(diào)控與損傷修復(fù)調(diào)節(jié)作用，在輔助治療新冠肺炎（危）重癥患者時表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，有效提高了病患的治愈率。該研究在2020年3月17日國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機制新聞發(fā)布會上獲國家科技部生物中心肯定[14]?；谛鹿诜窝住⑿乃ズ?型糖尿病腎病的hUC-MSCs臨床研究初探，有效加快了我國的干細胞臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用步伐。

眾所周知，干細胞資源庫作為干細胞與轉(zhuǎn)化研究的基石，在再生醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)與疾病診療等方面起到重要作用。而hUC-MSCs作為再生醫(yī)學(xué)和組織工程理想的種子細胞，在人類重大疾病治療中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，受到了廣泛關(guān)注。本研究建立的hUC-MSCs資源庫和應(yīng)用初探勢必加速我國干細胞資源庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)以及干細胞的臨床轉(zhuǎn)化，其不僅可為干細胞臨床研究和應(yīng)用服務(wù)，也可為基礎(chǔ)科學(xué)研究和國家應(yīng)急等提供資源保障和支撐。這對于現(xiàn)階段我國全力推進干細胞產(chǎn)業(yè)化，加快醫(yī)療新技術(shù)在臨床中的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用具有重大現(xiàn)實意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突