武建超，袁 敏，，徐 斐，曹 慧，于勁松，

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2.上海理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究所，上海200093）

適配體技術(shù)是分析檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)新興技術(shù)，主要原理是核酸適配體能夠與靶分子通過(guò)氫鍵、疏水作用、范德華力等分子作用發(fā)生特異性的結(jié)合，形成諸如發(fā)夾、凸環(huán)、G－四聚體等特殊三維結(jié)構(gòu)，然后利用相關(guān)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)靶分子的快速、靈敏、特異性檢測(cè)［1］。該法目前被廣泛應(yīng)用于重金屬及DNA、蛋白質(zhì)等生化物質(zhì)的快速靈敏檢測(cè)。Zhou等［2］利用有熒光基團(tuán)修飾的適配體與Ag＋發(fā)生特異性的結(jié)合，生成C－Ag－C的雙鏈結(jié)構(gòu)，之后通過(guò)傳感器即可檢測(cè)Ag＋含量。有研究者［3－5］利用含2個(gè)T 堿基的適配體與Hg2＋形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)檢測(cè)水中Hg2＋含量。上述研究均是在將特定適配體固定在載體的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。而常見(jiàn)的固定載體包括VT 共聚物、纖維素載體、樹(shù)脂、金片、水凝膠載體、玻片等。前5種固定載體存在一定弊端，如較低的固定率、復(fù)雜的操作過(guò)程、材料昂貴且較難獲取等。而玻片價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、固定效果較好，作為常用載體被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)相關(guān)的各項(xiàng)研究［6－8］。

目前，相關(guān)研究多采用經(jīng)過(guò)修飾的核酸片段固定到玻片表面或者采用特定基團(tuán)修飾玻片，應(yīng)用成本相對(duì)較高［9］，且對(duì)玻片固定適配體的條件優(yōu)化尚無(wú)深入研究。作者以硅烷化玻片為載體，將未經(jīng)修飾的核酸適配體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法直接固定在玻片上，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察硅烷化試劑濃度、硅烷化反應(yīng)溫度和時(shí)間以及適配體與玻片反應(yīng)時(shí)間和溫度、適配體濃度和長(zhǎng)度對(duì)適配體固定率的影響，優(yōu)化了適配體的固定條件，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)水溶液中Hg2＋的吸附，達(dá)到初步富集和去除Hg2＋的功能，為后續(xù)富集水中Hg2＋的研究開(kāi)拓了新的研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

玻片（18mm×18mm×0.17mm）；適配體片段：AP－16：5′－AGTGATTCGTATTACC－3′、AP－20：5′－TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT－3′、AP－21：5′－TTCTTTCTTGGGTTGTTTTGTT－3′、AP－22：5′－ATCGAGATAGTAAGTGCAATCT－3′、AP－44：5′－ACTACTCTCATCATACTCTGGGGACTGTGTTTGTTGTGTGTTGT－3′、AP－50：5′－ATCGAGATAGTAAGTGCAATCT－3′、AP－76：5′－ATTTTACAGAAC AACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC－3′，生工生物工程上海股份有限公司。

γ－縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GOPS）、1－甲基咪唑、3－（N－嗎啡啉）丙磺酸（MOPS），阿拉丁試劑有限公司；二甲基亞砜、丙酮、無(wú)水乙醇、硝酸鈉、氯化鈉、檸檬酸二鈉、氫氧化鈉、濃硝酸、濃鹽酸、濃硫酸、雙氧水，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。MiliQ 超純水；自制。

TG16－WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，金壇恒豐儀器廠；HH 型系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇科析儀器有限公司；FA2204B型電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop 2000／2000C 型超微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；普蘭德單道可調(diào)移液器，德國(guó)普蘭德公司；調(diào)溫萬(wàn)用電爐、101A－2S型數(shù)顯不銹鋼電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；LHS－150SC型智能恒溫恒濕箱，南通利豪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GBC 型原子吸收光譜儀，澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司。

1.2 緩沖溶液的配制

緩沖溶液：用移液器移取0.1 mL 1－甲基咪唑、1.255mL二甲基亞砜、11.19mL雙蒸水于燒杯中，將pH 值調(diào)至10.0，備用。

1×SSC 緩沖溶液：分別稱取0.876g 氯化鈉、0.411g檸檬酸二鈉，定容于100 mL 容量瓶，之后轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0，備用。

1.3 適配體的固定化

1.3.1 玻片的羥基化

將玻片放入30%雙氧水和98%濃硫酸混合溶液（體積比1∶3）中，于電爐上煮至微沸后取下冷卻至室溫，去除廢液并用大量雙蒸水沖洗玻片數(shù)次，烘干，備用。

1.3.2 玻片的硅烷化

取11.4μL GOPS溶液，加入50mL丙酮溶液中，稀釋成1×10－3mol·L－1的混合溶液。然后將羥基化后的玻片浸入該溶液中，室溫反應(yīng)30min后取出。分別用丙酮和無(wú)水乙醇沖洗3 次，以除去未結(jié)合的GOPS，最后將洗凈的玻片烘干。玻片硅烷化的原理如圖1所示。

圖1 玻片硅烷化的原理Fig.1 The principle of silylation on the glass chips

1.3.3 適配體在玻片上的固定

分別移取18μL緩沖溶液和1μL 1×10－4mol·L－1的適配體溶液于200μL 離心管中混合均勻，制得濃度為5.3×10－6mol·L－1的反應(yīng)適配體溶液。取9.6μL反應(yīng)適配體溶液均勻涂抹于玻片表面后，將其放至恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，45 ℃下反應(yīng)120min［10－13］，剩余溶液用于檢測(cè)適配體反應(yīng)液的質(zhì)量濃度。適配體在玻片表面固定的原理如圖2所示。

圖2 適配體固定到玻片上的原理Fig.2 The principle of fixing aptamers on the surface of glass chips

1.3.4 適配體固定率的計(jì)算

反應(yīng)過(guò)后的玻片用1×SSC 緩沖溶液沖洗4 次，再用MiliQ 超純水沖洗2次，共得到96μL的洗脫液，收集于200μL離心管中，混勻2min。用移液器移取2μL樣品滴于檢測(cè)儀器上進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次。實(shí)驗(yàn)所用洗脫液的體積為反應(yīng)適配體溶液體積的10倍，通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)適配體溶液和洗脫溶液的濃度進(jìn)行檢測(cè)，適配體在玻片上的固定率按式（1）計(jì)算：

1.4 適配體對(duì)水溶液中Hg2＋的吸附

將修飾有適配體的玻片浸沒(méi)于20mL 0.1mol·L－1的HgCl2溶液（內(nèi)有1×10－5mol·L－1MOPS，1×10－4mol·L－1NaNO3，pH＝11）中，15 ℃下反應(yīng)3h［10］。取出玻片，用少量雙蒸水將玻片表面未結(jié)合適配體的游離Hg2＋沖洗干凈，沖洗廢液和浸泡過(guò)玻片的溶液合并定容至50mL。用原子吸收光譜儀通過(guò)冷原子吸收光譜法檢測(cè)廢液中Hg2＋的濃度，從而得到玻片上適配體所吸附的汞量，適配體吸附Hg2＋的吸附效率按式（2）計(jì)算：

式中：c0為浸泡過(guò)空白玻片的HgCl2溶液定容至50mL時(shí)的Hg2＋濃度；c1為與玻片上固定的適配體反應(yīng)后殘余的HgCl2溶液定容至50mL時(shí)的Hg2＋濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅烷化試劑濃度對(duì)適配體固定率的影響

將濃度為1.59×10－5mol·L－1的AP－16適配體涂抹在20 ℃下分別用濃度為0 mol·L－1、1×10－3mol·L－1、2×10－3mol·L－1、4×10－3mol·L－1、8×10－3mol·L－1、16×10－3mol·L－1的硅烷化試劑處理30min后的玻片表面，于45℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中固定化反應(yīng)120min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 硅烷化試劑濃度對(duì)適配體固定率的影響Fig.3 Effect of concentration of silylation reagent on fixed rate of aptamers

由圖3可知，隨著硅烷化試劑濃度的增大，適配體固定率先升后降，當(dāng)硅烷化試劑濃度為4×10－3mol·L－1時(shí)，適配體固定率最高。未進(jìn)行硅烷化處理的玻片仍然能夠吸附25.23%的適配體。這主要是靠玻片和適配體之間的電荷相互吸引達(dá)到固定效果。而如果硅烷化試劑濃度過(guò)高，會(huì)使其在玻片表面的密度過(guò)大，發(fā)生重疊，降低了環(huán)氧基團(tuán)與適配體分子的結(jié)合效力，導(dǎo)致適配體固定率降低。因此，硅烷化試劑濃度以4×10－3mol·L－1為宜。

2.2 硅烷化反應(yīng)溫度對(duì)適配體固定率的影響

硅烷化反應(yīng)溫度設(shè)定為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，硅烷化反應(yīng)時(shí)間為30min，硅烷化試劑濃度為4×10－3mol·L－1，將1.59×10－5mol·L－1的AP－16適配體在45 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中固定化反應(yīng)120min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 硅烷化反應(yīng)溫度對(duì)適配體固定率的影響Fig.4 Effect of silylation reaction temperature on fixed rate of aptamers

由圖4可知，當(dāng)硅烷化反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，適配體固定率最高，達(dá)到66%。當(dāng)硅烷化反應(yīng)溫度低于45 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，適配體固定率不斷升高，硅烷化反應(yīng)溫度的升高有利于Si－O－Si鍵的形成。但當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，高溫會(huì)使環(huán)氧基團(tuán)失去活性，破壞了硅烷化試劑和適配體的結(jié)合，適配體固定率大幅降低［15］。因此，硅烷化反應(yīng)溫度以45 ℃為宜。

2.3 硅烷化反應(yīng)時(shí)間對(duì)適配體固定率的影響

玻片在45 ℃下經(jīng)4×10－3mol·L－1硅烷化試劑分別處理15 min、30 min、45 min、60 min、120 min、150min，表面涂抹濃度為1.59×10－5mol·L－1的AP－16適配體，在45℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中固定化反應(yīng)120min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 硅烷化反應(yīng)時(shí)間對(duì)適配體固定率的影響Fig.5 Effect of silylation reaction time on fixed rate of aptamers

由圖5可知，硅烷化反應(yīng)時(shí)間從15min延長(zhǎng)到30 min時(shí)，適配體固定率明顯提高，之后隨著硅烷化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，適配體固定率增幅趨緩，在硅烷化反應(yīng)時(shí)間為60min 時(shí)，適配體固定率最高，達(dá)67.25%。為提高操作效率，選擇硅烷化反應(yīng)時(shí)間為30min。由于玻片上的羥基和GOPS發(fā)生反應(yīng)需要一定的時(shí)間，反應(yīng)60min硅烷化基本結(jié)束，反應(yīng)30 min的適配體固定率為62.05 %，與反應(yīng)60 min 適配體固定率為67.8%相差不大。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)硅烷化反應(yīng)時(shí)間能夠提高適配體在玻片上的固定率。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)適配體固定率的影響

玻片在20 ℃下經(jīng)過(guò)濃度為4×10－3mol·L－1的硅烷化試劑處理30 min，然后將濃度為1.06×10－5mol·L－1AP－16 適配體涂抹于玻片上，將其放入45 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中分別固定化反應(yīng)15 min、30min、60 min、120 min、150 min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)適配體固定率的影響Fig.6 Effect of reaction time on fixed rate of aptamers

由圖6可知，適配體和玻片表面的硅烷化試劑的反應(yīng)主要發(fā)生在15～120min之間。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，適配體固定率呈上升趨勢(shì)，120min后反應(yīng)基本結(jié)束，適配體固定率急速降低。這可能是因?yàn)?，表面硅烷偶?lián)劑分子層長(zhǎng)期受熱，使其自聚交聯(lián)或者氧化造成Si－O－Si鍵斷裂［14］。因此，反應(yīng)時(shí)間以120 min為宜。

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)適配體固定率的影響

將濃度為1.06×10－5mol·L－1AP－16適配體涂抹于在20 ℃下經(jīng)過(guò)濃度為4×10－3mol·L－1的硅烷化試劑處理30min后的玻片上，分別在25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中固定化反應(yīng)120min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)適配體固定率的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on fixed rate of aptamers

由圖7可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，適配體固定率逐漸上升；當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)45 ℃后，適配體固定率基本保持穩(wěn)定。這可能是因?yàn)?，反?yīng)溫度過(guò)低，適配體上的末端磷酸根與硅烷化試劑的環(huán)氧基團(tuán)的開(kāi)環(huán)反應(yīng)不充分，不利于適配體在玻片上的固定。反應(yīng)溫度超過(guò)45 ℃后，反應(yīng)較為穩(wěn)定，即使達(dá)到75 ℃的高溫，適配體固定率變化也不大，說(shuō)明該固定方法對(duì)反應(yīng)溫度較為寬容。綜合考慮，反應(yīng)溫度以45 ℃為宜。

2.6 適配體濃度對(duì)適配體固定率的影響

將濃度分別為5.3×10－6mol·L－1、10.6×10－6mol·L－1、15.9×10－6mol·L－1、21.2×10－6mol·L－1、26.5×10－6mol·L－1的適配體涂抹于在20℃下經(jīng)濃度為4×10－3mol·L－1的硅烷化試劑處理30min后的玻片上，在45℃下固定化反應(yīng)120min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 適配體濃度對(duì)適配體固定率的影響Fig.8 Effect of concentration of aptamers on fixed rate of aptamers

由圖8可知，當(dāng)適配體濃度在5.3×10－6～15.9×10－6mol·L－1之間時(shí)，隨著適配體濃度的增大，適配體固定率逐漸上升；當(dāng)適配體濃度為15.9×10－6mol·L－1時(shí)，適配體固定率最高，達(dá)到60.46%；之后隨著適配體濃度的繼續(xù)增大，適配體固定率逐漸降低。這可能是因?yàn)?，適配體片段在玻片上的密度過(guò)大，重疊度較高，導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。因此，適配體濃度以15.9×10－6mol·L－1為宜。

2.7 適配體長(zhǎng)度對(duì)適配體固定率的影響

將濃度為5.3×10－6mol·L－1的AP－16、AP－21、AP－44、AP－50、AP－76適配體涂抹于在20 ℃下經(jīng)濃度為4×10－3mol·L－1的硅烷化試劑處理30min后的玻片上，在45 ℃下固定化反應(yīng)120 min，檢測(cè)適配體固定率，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 適配體長(zhǎng)度對(duì)適配體固定率的影響Fig.9 Effect of aptamers length on fixed rate of aptamers

由圖9可知，適配體固定率隨著堿基數(shù)目的增加即適配體長(zhǎng)度的增加而降低。當(dāng)堿基數(shù)目由50增至76時(shí)，適配體固定率的降低尤為明顯。一方面，由于適配體長(zhǎng)度的增加導(dǎo)致其在玻片上可能卷曲，增加了適配體末端磷酸根離子和玻片上硅烷化的環(huán)氧基團(tuán)結(jié)合的難度；另一方面，適配體長(zhǎng)度的增加，其對(duì)應(yīng)的分子量增加，使得懸掛在玻片上的力相應(yīng)增大，因此增加了適配體從玻片上脫落的幾率，導(dǎo)致適配體固定率降低。因此，適配體長(zhǎng)度以16個(gè)堿基即AP－16為宜。

2.8 對(duì)水中Hg2＋的吸附

將玻片按照優(yōu)化條件分別固定AP－20和AP－22，其中AP－20為能夠特異性吸附Hg2＋的適配體，AP－22作為對(duì)照。AP－20 和AP－22 的平均固定率分別為50.61%和49.51%，較AP－16 的最優(yōu)固定率（67.25%）略低，這是由于堿基數(shù)量的增加導(dǎo)致的。將相同的玻片分別均勻地放到20 mL 濃度為1×10－7mol·L－1的HgCl2溶液中，并做空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 固定有適配體的玻片對(duì)Hg2＋的吸附Fig.10 Hg2＋Adsorbed by glass chips with immobilized aptamers

空白對(duì)照組的數(shù)據(jù)在原子吸收光譜儀允許的誤差范圍內(nèi)［16－17］。由圖10可知，空白玻片和固定了AP－22的玻片都沒(méi)有吸附溶液中的Hg2＋，而固定有AP－20的玻片對(duì)Hg2＋具有明顯的吸附作用。經(jīng)計(jì)算，固定在玻片上的AP－20吸附Hg2＋的量為52.97×10－9g，吸附效率為49.84%。而固定AP－22的玻片，其洗脫溶液的濃度和空白組接近，表明非特異性吸附Hg2＋的適配體AP－22不能吸附水溶液中的Hg2＋。

3 結(jié)論

以玻片為載體，采用共價(jià)偶聯(lián)法對(duì)適配體進(jìn)行了固定，考察了硅烷化試劑濃度、硅烷化溫度和時(shí)間、適配體與玻片的反應(yīng)時(shí)間和溫度、適配體濃度和長(zhǎng)度對(duì)適配體固定率的影響，確定了固定適配體于玻片上的最佳條件：濃度為1.59×10－5mol·L－1AP－16適配體與硅烷化玻片在45 ℃下反應(yīng)120min，最佳硅烷化條件：濃度為4×10－3mol·L－1的硅烷化試劑在45 ℃下反應(yīng)30 min。該條件下，適配體的固定率達(dá)62.05%。該法固定化適配體于玻片上具有操作簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)。在該最優(yōu)條件下，將適配體AP－20固定在玻片上，初步探索了其對(duì)水溶液中Hg2＋的吸附效果，固定有適配體的單個(gè)玻片吸附Hg2＋的效率為49.84%，為利用適配體對(duì)水中重金屬的富集與去除提供了一種新的研究思路和參考。

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