姚遠(yuǎn)

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，胃腸腫瘤生物學(xué)研究室 300060

0 引言

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，我國(guó)是世界上胃癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一。目前，臨床上針對(duì)胃癌的早期診斷方案尚未健全，因此開展特異性靶點(diǎn)研究對(duì)于了解胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及臨床早期診治尤為重要，而揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制也對(duì)后期相關(guān)治療具有重要意義[2]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和在線數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，根據(jù)已驗(yàn)證的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行研究已成為癌癥研究不可或缺的一部分。本研究中，對(duì)胃癌基因芯片GSE63121（miRNA）[3]和GSE2685（mRNA）[4]進(jìn)行分析，以獲得胃癌中明顯差異表達(dá)的基因，并通過(guò)基因腫瘤學(xué)（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行富集分析，從而對(duì)差異表達(dá)基因的作用途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)，在蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction networks，PPI）中對(duì)差異基因在蛋白水平的作用進(jìn)行評(píng)估，再使用基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)和TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行再一次篩選富集，以尋找胃癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

從高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索到的胃癌相關(guān)基因表達(dá)芯片為GSE63121（miRNA）和GSE2685（mRNA）。在這些數(shù)據(jù)中，實(shí)驗(yàn)組為胃癌組織樣本（樣本數(shù)均大于15），對(duì)照組為正常胃組織樣品。所獲得的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)提供了足夠的信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析。其中，GSE2685數(shù)據(jù)中包含22例胃癌組織樣本和8例正常胃組織樣本；GSE63121數(shù)據(jù)中包含15例胃癌組織樣本和15例正常胃組織樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理與分析

利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GEO2R在線工具對(duì)篩選到2個(gè)胃癌相關(guān)的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，從中提取出基因表達(dá)矩陣。隨后，使用R語(yǔ)言提供的DESeq2工具包對(duì)基因表達(dá)矩陣中的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，并根據(jù)調(diào)整P值和篩選閾值（|Log2FC|）對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，其中FC（fold change）表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間表達(dá)量的比值。篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05、|Log2FC|＞1.0。繪制胃癌相關(guān)差異表達(dá)mRNA和miRNA基因的火山圖。

1.3 差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因預(yù)測(cè)

使用miRDB（http://mirdb.org/）對(duì)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)中差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將預(yù)測(cè)到的潛在靶基因與篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行互相映射，得到兩者的共有基因，用于富集分析。

1.4 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

使用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)(the database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。由于DAVID是一套完整的基因功能在線注釋工具，能夠較為方便地為研究者提供基因背后的生物學(xué)意義。將篩選到的差異表達(dá)基因的基因符號(hào)（gene symbol）輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 蛋白-蛋白相互作用以及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步分析GSE63121和GSE2685中共有的差異表達(dá)基因的功能，使用檢索相互作用基因的搜索工具（the search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）對(duì)差異表達(dá)基因之間可能存在的或已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測(cè)。將GSE63121和GSE2685中共有的差異表達(dá)基因的基因符號(hào)（gene symbol）輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析，然后選取相互作用分值大于0.4的基因進(jìn)行可視化分析。

1.6 基因表達(dá)譜分析

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene）分析來(lái)自癌癥基因組圖集（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃癌相關(guān)差異基因和患者總生存期（overall survival，OS）之間的相關(guān)性。

1.7 腫瘤免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)分析

使用TIMER2.0（http://timer.cistrome.org/）分析最終篩選到的基因的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)mRNA潛在靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

當(dāng)以P＜0.05、|Log2FC|＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，使用DESeq2工具包共獲得了734種差異表達(dá)的mRNA基因（下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)分別為473和261）和20個(gè)差異表達(dá)的miRNA基因（上調(diào)和下調(diào)的miRNA數(shù)分別為1和19）。（圖1）

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖

2.2 GO和KEGG富集分析結(jié)果

富集分析結(jié)果如圖2和圖3所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要注釋到GO terms，功能涉及細(xì)胞組成或生物發(fā)生、應(yīng)答刺激反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及發(fā)育過(guò)程等。此外，這些差異表達(dá)基因可能參與的代謝途徑主要有參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展、細(xì)胞焦點(diǎn)連接形成、p13K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體受體連接途徑以及藥物代謝-細(xì)胞色素P450代謝通路。表1和表2種列出了富集分析的詳細(xì)結(jié)果。上述結(jié)果表明，這些差異表達(dá)基因可能通過(guò)多種代謝途徑來(lái)響應(yīng)機(jī)體應(yīng)對(duì)胃癌造成的損傷。

表2 差異表達(dá)基因的京都基因和基因組百科全書（KEGG）代謝途徑富集分析結(jié)果

圖3 差異表達(dá)基因的京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

表1 差異表達(dá)基因的基因腫瘤學(xué)（GO）富集分析結(jié)果詳情（前20位）

圖2 差異表達(dá)基因的基因腫瘤學(xué)（GO）富集分析

2.3 差異表達(dá)miRNA潛在靶基因預(yù)測(cè)及共有差異表達(dá)基因鑒定結(jié)果

miRNA作為一類非編碼單鏈小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種代謝途徑。為尋找胃癌相關(guān)的miRNA并構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本文中對(duì)鑒定到的差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到2 740種潛在靶基因。進(jìn)一步，將這些潛在靶基因與之前得到的胃癌相關(guān)差異表達(dá)mRNA的靶基因（共734種）進(jìn)行相互映射。共篩選到103種差異表達(dá)miRNA和mRNA的潛在靶基因，稱為共有差異表達(dá)基因，這些基因在胃癌組織均差異表達(dá)。上述結(jié)果表明，miRNA通過(guò)調(diào)控mRNA的表達(dá)來(lái)應(yīng)答胃癌的發(fā)展。

2.4 共有差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將103種共有差異表達(dá)基因的基因符號(hào)（gene symbol）輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，總共得到103個(gè)節(jié)點(diǎn)，221條邊，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度為4.29，如圖4所示。結(jié)果表明，C-X-C基序趨化因子 配 體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）、蛋白激酶cAMP依賴性Ⅱ型調(diào)節(jié)亞基β（protein kinase cAMP-dependent typeⅡregulatory subunit beta，PRKAR2B）、蛋白激酶cAMP依賴性催化β（protein kinase cAMP dependent catalytic beta，PRKACB）、KIT（KIT原癌基因）、C-X-C基序趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）和發(fā)動(dòng)蛋白（Dynamin 1，DNM1）等基因位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，且和許多差異表達(dá)基因存在相互作用關(guān)系，表明這些基因在胃癌形成以及機(jī)體應(yīng)對(duì)胃癌的過(guò)程中扮演重要的角色。進(jìn)一步分析可知，CREB1和ESR1這兩種基因與胃癌具有較強(qiáng)的相關(guān)性，且在GSE2685數(shù)據(jù)中，這兩種基因的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，變化率分別為-1.08%和-1.46%。這兩種基因參與多條代謝通路，如代謝類，免疫調(diào)節(jié)類等。

圖4 共有差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

2.5 差異表達(dá)基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系

在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，當(dāng)將截?cái)嘀担╟ut off）設(shè)置為“median”，以95%CI為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并將預(yù)后節(jié)點(diǎn)設(shè)為120個(gè)月，此時(shí)的生存分析結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，CREB1和ESR1低表組胃癌患者的預(yù)后明顯著好于高表達(dá)組。

圖5 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）和雌激素受體1（ESR1）表達(dá)水平與胃癌患者生存率的關(guān)系

2.6 腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析結(jié)果

由于富集分析結(jié)果提示差異表達(dá)基因涉及的主要途徑為免疫過(guò)程，因此使用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析CREB1和ESR1與Tregs細(xì)胞豐度的相關(guān)性。如圖6所示，CREB1（ρ＞0，P=7.21×10-18）和ESR1（ρ＞0，P=4.46×10-26）與Tregs細(xì)胞的豐度均正相關(guān)。該結(jié)果提示CREB1和ESR1高表達(dá)可能會(huì)提高腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。

圖6 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CRE B1）和雌激素受體1（ESR1）與胃癌的Treg細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平

3 討論與結(jié)論

胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，其早期診斷和治療一直是研究熱點(diǎn)。本研究中使用生物信息學(xué)方法分析與胃癌相關(guān)的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)并成功篩選到CREB1和ESR1基因，進(jìn)而對(duì)這兩種基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果表明，CREB1和ESR1在胃癌患者中表達(dá)升高，說(shuō)明二者參與調(diào)節(jié)胃癌微環(huán)境中免疫系統(tǒng)的構(gòu)成，且通過(guò)調(diào)節(jié)免疫作用來(lái)影響胃癌的發(fā)展。

在小鼠結(jié)腸炎模型中，alpinetin會(huì)上調(diào)CREB1與Foxp3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，通過(guò)調(diào)控miRNA-302/DNMT-1/CREB1信號(hào)通路促進(jìn)Tregs細(xì)胞分化。與腫瘤環(huán)境相反的是，過(guò)表達(dá)CREB1在炎癥中可以有效改善病情[5]。在胰腺癌模型中，靶向CREB1可抑制胰腺腫瘤的發(fā)展[6]。已有研究結(jié)果表明，CREB1在腫瘤組織中異常高表達(dá)且對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用[7]，CREB1可通過(guò)調(diào)控p-Akt和mTOR信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[8]。此外，結(jié)直腸癌組織中通常高表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter 3，GLUT3），而葡萄糖代謝降低時(shí)會(huì)產(chǎn)生低糖應(yīng)激效應(yīng)，通過(guò)AMPK/CREB1途徑顯著上調(diào)GLUT3[9]，同時(shí)伴隨不良預(yù)后。在乳腺癌模型中，突變激活ESR1會(huì)對(duì)芳香化酶抑制劑產(chǎn)生抗性，這使ESR1成為潛在的作用靶點(diǎn)[10]。ESR1是乳腺癌中常見的驅(qū)動(dòng)基因[11]，表達(dá)ESR1時(shí)會(huì)增強(qiáng)突變信號(hào)。研究結(jié)果表明，ESR1與轉(zhuǎn)移性乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[12]。在轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中會(huì)出現(xiàn)高豐度的基因組突變，這往往與腫瘤的免疫浸潤(rùn)相關(guān)[13-14]。然而，目前尚未見到關(guān)于上述機(jī)制在胃癌中作用的相關(guān)報(bào)道。但現(xiàn)有研究結(jié)果均支持CREB1和ESR1在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可以影響免疫浸潤(rùn)，同時(shí)調(diào)節(jié)相關(guān)通路，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡發(fā)揮作用。然而，現(xiàn)有的研究均在胃癌指標(biāo)選擇方面或多或少存在相對(duì)局限性，因此開展多種功能交叉聯(lián)合診斷研究對(duì)臨床有重要意義。

綜上，本研究中使用生物信息學(xué)方法找到CREB1和ESR1這兩種胃癌相關(guān)的差異表達(dá)基因，推測(cè)二者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中影響免疫浸潤(rùn)，同時(shí)通過(guò)相關(guān)調(diào)節(jié)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等。CREB1和ESR1有望成為研究胃癌發(fā)病機(jī)制和分子機(jī)制及臨床應(yīng)用的重要靶點(diǎn)，后續(xù)可進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突