李倩，劉丹彤，姚海榮，齊冰麗

(滄州市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 滄州 061000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮癌，患者生存預(yù)后較差[1]。目前臨床上主要采用手術(shù)結(jié)合放療和化療等綜合方案治療卵巢癌，但是治療效果不令人滿意。深入分析卵巢癌的發(fā)病機制，并開發(fā)出新的治療靶點有重要意義[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，在表觀遺傳學(xué)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。既往研究證實，lncRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移和細(xì)胞周期的調(diào)控中起到重要作用。近年來，lncRNA在卵巢癌診斷和治療中的作用引起了廣泛重視[3]。LINC00339是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在乳腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和膠質(zhì)瘤中表達水平升高[4-7]。LINC00339在卵巢癌中的作用及其機制既往少有報道。miR-520a-3p在腫瘤中可能發(fā)揮抑癌基因作用[8-9]。本課題組前期用Target Scan軟件預(yù)測到微小RNA(microRNA，miRNA)-520a-3p可能是LINC00339的靶基因。本研究分析LINC00339對miR-520a-3p的靶向調(diào)控作用，并分析其對卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，旨在闡明LINC00339在卵巢癌中的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3、A2780、OVCAR3、HO-8910)和正常卵巢上皮細(xì)胞系(HOSEpiC)均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購于廣州碩恒生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑購于美國Sigma公司；sh-LINC00339、anti-miR-520a-3p、miR-520a-3p mimics、pcDNA3.1-LINC00339及其對照質(zhì)粒均購于美國Invitrogen公司；引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計并提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒、Transwell小室、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠快速制備試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購于英國Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2倍稀釋的SYBR綠色熒光染料實時PCR試劑盒購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測細(xì)胞中LINC00339和miR-520a-3p的相對表達水平

用TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，反應(yīng)體系為2 μl 5倍稀釋的反應(yīng)混合液、1 μl RNA和7 μl H2O，條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。隨后用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒，以cDNA為模板進行PCR，反應(yīng)體系為10 μl SYBR、1 μl cDNA、1 μl引物和8 μl H2O，條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s(40個循環(huán))，72 ℃ 10 min。用2-△△Ct法計算LINC00339和miR-520a-3p相對表達量。引物序列：LINC00339：上游5′-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3′，下游5′-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3′；miR-520a-3p：上游5′-CGAGAGGGCTGGTCCTT-3′，下游5′-GTCCCGAATGTGCTGAGTT-3′；GAPDH：上游5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。

1.3 沉默LINC00339對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的影響

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。待細(xì)胞融合度達80%時進行傳代。轉(zhuǎn)染前24 h將SKOV3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合達40%時取sh-NC和sh-LINC00339，用血清培養(yǎng)基稀釋至100 nmol·L-1，每孔加入2 ml。隨后加入LipofectamineTM2000試劑進行轉(zhuǎn)染，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全RPMI-1640培養(yǎng)基，48 h后取對數(shù)生長期細(xì)胞進行后續(xù)檢測。

1.3.2 克隆形成實驗和MTT實驗檢測SKOV3細(xì)胞增殖活力 克隆形成實驗：收集對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時停止培養(yǎng)，用4 %多聚甲醛進行固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)目。MTT實驗：收集對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，加入MTT溶液，避光孵育4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀(490 nm波長)上檢測光密度(OD)值，反映細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 Transwell實驗檢測SKOV3細(xì)胞侵襲力 首先在Transwell板上室鋪基質(zhì)膠(用無血清培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋8倍)，隨后將SKOV3細(xì)胞接種于Transwell小室；下室中加入細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的SKOV3細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色15 min，隨后用PBS洗滌3次，待干燥后在顯微鏡下取5個視野進行觀察，計算平均侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 雙熒光素酶報告基因驗證LINC00339和miR-520a-3p的靶向作用關(guān)系

將LINC00339突變型熒光素酶報告載體(LINC00339-MUT)、野生型熒光素酶報告載體(LINC00339-WT)分別同miR-520a-3p模擬物、模擬陰性對照共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性。為了進一步驗證LINC00339與miR-520a-3p的靶向關(guān)系，向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒，步驟同1.3.1。將細(xì)胞分為：(1) 對照組(miR-NC組)、模擬物組(miR-520a-3p mimics組)、miR-520a-3p抑制組(anti-miR-520a-3p組)，檢測各組LINC00339相對表達水平(方法同1.2)；(2) 空載體組(pcDNA3.1組)、LINC00339過表達組(pcDNA3.1-LINC00339組)、陰性對照組(sh-NC組)、LINC00339抑制組(sh-LINC00339組)，檢測各組miR-520a-3p相對表達水平(方法同1.2)。

1.5 LINC00339靶向miR-520a-3p對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的影響

用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，步驟同1.3.1。將SKOV3細(xì)胞分為對照組(sh-NC+miR-NC組)、LINC00339抑制組(sh-LINC00339+miR-NC組)、LINC00339抑制+miR-520a-3p抑制組(sh-LINC00339+anti-miR-520a-3p組),檢測各組細(xì)胞增殖(方法同1.3.2)和侵襲(方法同1.3.3)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 LINC00339和miR-520a-3p在卵巢癌細(xì)胞中的表達

與HOSEpiC細(xì)胞比較，SKOV3、A2780、OVCAR3和HO-8910細(xì)胞中LINC00339相對表達量明顯升高(均P<0.001)，而miR-520a-3p相對表達量明顯降低(均P<0.001)，見圖1。

2.2 沉默LINC00339對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲和影響

與sh-NC組比較，sh-LINC00339組LINC00339相對表達量，克隆細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染24、48、72h時細(xì)胞增殖活力和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低(均P<0.05)，見圖2。

2.3 LINC00339靶向miR-520a-3p的鑒定

Target Scan軟件預(yù)測到LINC00339和miR-520a-3p有結(jié)合位點(圖3A)。miR-520a-3pmimics可以明顯抑制PGLO-LINC00339-WT的熒光素酶活性(P<0.001)，而anti-miR-520a-3p可以增強PGLO-LINC00339-WT活性(P<0.001，圖3B)。miR-520a-3pmimics可以下調(diào)LINC00339表達水平(P=0.018)，而anti-miR-520a-3p可以上調(diào)LINC00339表達水平(P<0.001，圖3C)。另外，pcDNA3.1-LINC00339可以下調(diào)miR-520a-3p相對表達量(P=0.001)，而sh-LINC00339可以上調(diào)miR-520a-3p相對表達量(P=0.031，圖3D)。以上結(jié)果說明LINC00339可以靶向作用于miR-520a-3p。

a與HOSEpiC細(xì)胞比較，P<0.05圖1 RT-PCR檢測卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞中LINC00339和miR-520a-3p的相對表達量

a 與sh-NC組比較，P<0.05A.RT-PCR檢測LINC00339相對表達量；B.克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖活力；C.MTT實驗檢測細(xì)胞增殖活力；D.Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力圖2 沉默LINC00339對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲和影響

a與miR-NC組比較，P<0.05；b與pcDNA3.1組比較，P<0.05；c與sh-NC組比較，P<0.05A.Target Scan軟件預(yù)測到LINC00339和miR-520a-3p有結(jié)合位點；B.各組熒光素酶活性；C.過表達或抑制miR-520a-3p對細(xì)胞LINC00339表達水平的影響；D.過表達或抑制LINC00339對細(xì)胞miR-520a-3p的影響圖3 LINC00339靶向miR-520a-3p的鑒定

2.4 LINC00339靶向miR-520a-3p對細(xì)胞增殖和侵襲的影響

共轉(zhuǎn)染sh-LINC00339和miRNA陰性對照質(zhì)粒后，克隆細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h時細(xì)胞增殖活力和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低(均P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染sh-LINC00339和anti-miR-520a-3p質(zhì)粒可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)(均P<0.05)，見圖4。

3 討 論

卵巢癌的發(fā)病機制目前尚未完全明確，表觀遺傳學(xué)調(diào)控在卵巢癌中的作用越來越受到重視[10]。lncRNA是表觀遺傳調(diào)控分子，不但可以調(diào)節(jié)組蛋白和DNA的化學(xué)修飾，而且能夠調(diào)控表觀遺傳通路本身的基因，進而從根本上對基因組的表達產(chǎn)生影響[2,11]。lncRNA在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，例如lncRNA ATB可以促進卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并且與患者不良生存預(yù)后有關(guān)[12]。lncRNA可能作為卵巢癌分子生物學(xué)標(biāo)志物，在卵巢癌早期診斷和治療中發(fā)揮重要作用[13]。

LINC00339也被稱為HSPC157，基因位于chr1:22，024，558-22，031，224(GRCh38/hg38)和chr1:22，351，681-22，357，716(GRCh37/hg19)，主要表達于卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[14]。與癌旁組織比較，卵巢癌組織中LINC00339表達水平較高[14]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3、A2780、OVCAR3、HO-8910)中LINC00339的相對表達量明顯高于正常卵巢上皮細(xì)胞系(HOSEpiC)，轉(zhuǎn)染LINC00339-siRNA后SKOV3細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力明顯下降，提示LINC00339可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

LINC00339在腫瘤中的作用機制目前尚未完全明確，lncRNA對miRNA的調(diào)節(jié)機制可能是其發(fā)揮作用的重要途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00339可以抑制miR-377-3p，上調(diào)DCP1A表達，進而促進胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[5]。Wang等[15]也發(fā)現(xiàn)，LINC00339靶向調(diào)控miR-377-3p/HOXC6，促進三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖，并抑制凋亡。在膠質(zhì)瘤中，LINC00339可以通過miR-539-5p/TWIST1/MMPs軸促進瘤組織血管新生[16]。LINC00339還能通過miR-145調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進食管鱗癌的進展[17]。

a 與sh-NC+miR-NC組比較，P<0.05；b 與sh-LINC00339+miR-NC組比較，P<0.05A.克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖；B.MTT實驗檢測細(xì)胞增殖；C.Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力圖4 LINC00339靶向miR-520a-3p對細(xì)胞增殖和侵襲的影響

miR-520a-3p在腫瘤中低表達，可能作為抑癌基因而發(fā)揮作用[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p可能通過EGFR信號通路[19]、JAK/STAT信號通路[9]和PI3K/AKT/mTOR信號通路[20]等抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。本課題組前期用Target Scan軟件預(yù)測到miR-520a-3p可能是LINC00339的靶基因，本研究中我們用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染sh-LINC00339和miRNA陰性對照質(zhì)粒后，克隆細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h時細(xì)胞增殖活力和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯下降，而共轉(zhuǎn)染sh-LINC00339和anti-miR-520a-3p質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)上述效應(yīng)。結(jié)果提示，LINC00339可能通過靶向作用于miR-520a-3p促進卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

本研究存在以下局限性：(1) 并未檢測增殖和侵襲相關(guān)蛋白指標(biāo)的變化；(2) 未直接分析miR-520a-3p下游分子信號通路的變化；(3) 未分析LINC00339與卵巢癌臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，LINC00339在卵巢癌細(xì)胞中高水平表達，可能通過靶向調(diào)控miR-520a-3p促進癌細(xì)胞的增殖和侵襲。LINC00339可能會成為卵巢癌的治療靶點，未來需要深入分析其潛在生物學(xué)機制，并且分析其臨床應(yīng)用價值。