周凌，孫慧婷，楊思慧，荊秀娟，周懷君

(1.南京醫(yī)科大學(xué) 鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210008；2.常州市第二人民醫(yī)院 生殖中心，江蘇 常州 213003；3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210008；4.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 婦產(chǎn)科,江蘇 南京 210008)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是最常見的婦科癌癥，也是世界四大女性癌癥之一。2020年估計(jì)美國有65 620名婦女被診斷為EC，約有12 590名婦女將死于這種疾病[1]。據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，我國EC發(fā)病率為33/10萬，死亡率為22/10萬[2]。盡管子宮內(nèi)膜樣腫瘤預(yù)后良好，但高達(dá)20%的患者會復(fù)發(fā)。對于漿液性腫瘤，約50%的患者病情惡化或不能通過一線治療治愈[3]。目前EC的治療原則以手術(shù)為主，輔以放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物治療等。內(nèi)分泌治療和化療是晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性EC患者最主要治療手段，然而其有效率較低，患者的中位生存時間仍短于1年[4]。治療失敗的原因就是耐藥，耐藥的產(chǎn)生來自兩方面的因素：內(nèi)因是各種形式的腫瘤異質(zhì)性，癌癥基因組不穩(wěn)定性；外因則是藥物的選擇壓力[5]。目前還做不到個體化的精準(zhǔn)治療，合適的綜合性治療也能使癌癥患者生存獲益，如藥物的聯(lián)合應(yīng)用，但是盲目地將不同的治療方法相疊加并不一定能得到1+1>2的效果[6]。近年來，化療+免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immunecheckpoint inhibitor，ICI)+抗血管生成治療為腫瘤微環(huán)境的重塑提供了新的方向。這種協(xié)同作用 在對IMpower 150 的研究中得到了印證，化療+抗血管生成治療+ICI 方案可使肝轉(zhuǎn)移的晚期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者的生存期顯著延長[7]。但是ICI所顯示出的較強(qiáng)毒副作用使其使用受到限制。而化療聯(lián)合抗血管生成治療因其毒副作用較小又能延長生存期，所以在各種晚期和復(fù)發(fā)性惡性腫瘤治療中得到廣泛使用?；熉?lián)合抗血管生成治療的效果強(qiáng)弱與藥物的選擇及給藥手段密切相關(guān)。

鉑類藥物作為一類經(jīng)典的抗癌藥物，在臨床化療上具有舉足輕重的地位，也是治療EC常用的藥物，經(jīng)過一代順鉑、二代卡鉑的改良研制出以奧沙利鉑為代表的三代鉑類藥物。奧沙利鉑通過與核DNA形成交叉聯(lián)結(jié)干擾DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)而發(fā)揮抗癌活性[8]。與其他鉑化合物相比奧沙利鉑因耐受性更好、毒副作用更小而得到廣泛應(yīng)用，但它仍然存在一些毒副作用，如神經(jīng)毒性、血液和胃腸道毒性、中性粒細(xì)胞減少、惡心和嘔吐等，這些無疑限制了其可用劑量范圍[9]。目前，采用聯(lián)合用藥對抗化療藥物的毒性及耐藥性是一種較好的方法。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，奧沙利鉑具有抑制EC裸鼠移植瘤生長的作用，又能抑制腫瘤組織中血管生成素2(angiopoietin 2，Ang2)的表達(dá)[10]。這提示我們奧沙利鉑與抗Ang2聯(lián)合應(yīng)用可能對抗EC起到協(xié)同作用。Ang/Tie 軸是介導(dǎo)血管重塑和新生血管成熟過程的信號通路[11]。生理狀態(tài)下，血管旁支持細(xì)胞如周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞分泌的Ang1可與Tie2結(jié)合，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞之間、內(nèi)皮細(xì)胞與血管外膜細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)血管成熟，并維持血管正常的有序結(jié)構(gòu)。但腫瘤細(xì)胞分泌Ang2，它可與Ang1 競爭性結(jié)合Tie2，而Ang2與Tie2 的結(jié)合并不能引起后續(xù)信號通路的正常激活[12-14]，因此，腫瘤新生血管具有結(jié)構(gòu)排列紊亂、血管壁不完整、血管壁不連續(xù)的特點(diǎn)[15]，從而進(jìn)一步加重局部乏氧狀態(tài)，并嚴(yán)重影響抗腫瘤藥物的投遞。腫瘤內(nèi)部處于高酸、低氧微環(huán)境，異常的血管結(jié)構(gòu)也為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了途徑。靶向Ang/Tie 軸的藥物能夠促進(jìn)腫瘤血管正常化，在防止腫瘤轉(zhuǎn)移的同時能夠與化療藥物或ICI聯(lián)合使用，增強(qiáng)藥物的遞送效率。促進(jìn)腫瘤血管正常化的抗血管生成療法與其他療法的聯(lián)合是治療腫瘤的新策略[12]。

RNA干擾，特別是小干擾RNA(siRNA)，提供了一種沉默特定基因來控制腫瘤血管生長的替代方法。雖然siRNA治療在體內(nèi)降解快、內(nèi)化差，但納米顆?？梢宰鳛槠錈o毒、高效的傳遞載體，甚至可以引入多種治療藥物的聯(lián)合傳遞[16-18]。本實(shí)驗(yàn)小組采用shRNA靶向 Ang2/Tie2 軸的抗血管生成療法促進(jìn)腫瘤血管的正?；?，研究shRNA靶向Ang2基因沉默聯(lián)合奧沙利鉑對子宮內(nèi)膜癌EC生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和奧沙利鉑使用劑量

人類EC Ishikawa細(xì)胞由北京大學(xué)人民醫(yī)院魏麗慧教授提供。細(xì)胞在加入10%胎牛血清和100 U·ml-1青霉素及100 U·ml-1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基[(賽默飛世爾科技(中國)有限公司]中培養(yǎng)。奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號:09111511)。使用奧沙利鉑處理細(xì)胞時,奧沙利鉑在細(xì)胞培養(yǎng)液中終濃度為10 mg·ml-1，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h或48 h[19]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

體外細(xì)胞和在體動物實(shí)驗(yàn)均隨機(jī)分為5組，分別為生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質(zhì)粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組。其中生理鹽水組、奧沙利鉑組的干預(yù)因素是生理鹽水，規(guī)避奧沙利鉑溶劑帶來的干擾；空載質(zhì)粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組干預(yù)因素是PBS和質(zhì)粒，設(shè)立空載質(zhì)粒組規(guī)避PBS和質(zhì)粒給實(shí)驗(yàn)組帶來的干擾；Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組既有Ang2的敲低又有奧沙利鉑雙重因素的干預(yù)。

1.3 Ang2 shRNA設(shè)計(jì)和構(gòu)建質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

由Genepharma(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)設(shè)計(jì)Ang2特異性shRNA，并合成攜帶Ang2 shRNA的pRNAT-CMV3.2-Neo及陰性對照pRNAT-CMV3.2-Neo-neg質(zhì)粒。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種293T細(xì)胞，在細(xì)胞融合度達(dá)50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Opti-MEM稀釋lipofectamineTM3000(美國賽默飛世爾科技公司)，同時使用Opti-MEM稀釋P3000TM，并將Ang2-shRNA的pRNAT-CMV3.2-Neo質(zhì)粒、PSPXA2質(zhì)粒及PMD2G質(zhì)粒按照4∶3∶1的比例混勻加入稀釋好的P3000TM中，按照同樣方法將陰性對照pRNAT-CMV3.2-Neo-neg質(zhì)粒與PSPXA2質(zhì)粒及PMD2G質(zhì)?；靹蚝蠹尤胂♂尯玫腜3000TM中。將稀釋后的lipofectamineTM3000分別與上述混合物共同孵育15 min，加入293T細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)24、48 h后收取細(xì)胞上清作為病毒液，將收取的病毒液加入融合度達(dá)30%的Ishikawa細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)72 h后加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)成功的Ishikawa細(xì)胞。

1.4 qRT-PCR分析Ang2 mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)制備細(xì)胞總RNA，用HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、cDNA和引物按比例混勻。使用QuantStudio 6 Flex(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行檢測。將GAPDH管家基因作為內(nèi)參基因，消除因提取的cDNA濃度不同產(chǎn)生的差異。Ang2正向引物5′-AACATCCCAGTCCACCTGAG-3 ′，反向引物5′-GGTCTTGCTTTGGTCCGTTA-3′；GAPDH正向引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，反向引物5′-ACCAGAGTTAAAAGCCCCTG-3′。cDNA按照按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個反應(yīng)循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每組設(shè)置3個復(fù)孔，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測Ang2蛋白相對含量

收集細(xì)胞或組織，使用RIPA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞或組織。按比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，沸水浴10 min使蛋白充分變性。將處理好的蛋白樣品加入配好的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠孔內(nèi)，電泳30 mV 20 min、50 mV 60 min，轉(zhuǎn)膜250 mV 120 min。將PMDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。用鼠標(biāo)單克隆抗體Ang2(MM0020-1F29,ab56301)[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]和鼠標(biāo)單克隆抗體GAPDH分別在4 ℃過夜孵育。用抗鼠辣根peroxidase-conjugated二抗[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]室溫孵育2 h。最后涂勻Immobilon Western 曝光液(美國默克密理博公司)，并用Tanon全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影。通過ImageJ對數(shù)字化自動圖像進(jìn)行密度分析。

1.6 Ishikawa細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集5×105個細(xì)胞，使用annexin V-PE凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)行凋亡檢測，用Buffer輕柔垂懸細(xì)胞，加入1 μl annexin V-PE進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,Becton Dickinson)檢測凋亡水平，并使用BD FACSDiva軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Ishikawa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用基質(zhì)膠[碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司] 1∶10包被24孔板的小室(corning，America)底部，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h使膠凝固。將Ishikawa細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基垂懸，按1×105個細(xì)胞·孔-1轉(zhuǎn)移上室中。將含10%胎牛血清的DMEM加入下室作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動。培養(yǎng)48 h后用棉簽輕輕擦去小室上層表面的細(xì)胞，在下室加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.5%結(jié)晶紫染色。在放大200倍的倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 動物實(shí)驗(yàn)

本研究經(jīng)南京大學(xué)附屬南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。40只4周齡雌性BALB/c裸小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)經(jīng)南京鼓樓醫(yī)院動物護(hù)理與使用委員會批準(zhǔn)使用，圈養(yǎng)在專門的SPF設(shè)施中。小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質(zhì)粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組，每組8只。用PBS按照1×107個細(xì)胞、0.2 ml·小鼠-1，用30 G針頭和1 ml注射器在動物背部皮下注射相應(yīng)細(xì)胞，每天觀察。當(dāng)腫瘤生長14 d時，生理鹽水組給予等同治療組劑量的生理鹽水腹腔注射，奧沙利鉑和Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑治療組給予奧沙利鉑(根據(jù)人小鼠體表面積換算方法，0.25 mg·m-2) 腹腔注射[20-21]，每周注射1次，連續(xù)5次。每兩天測量1次腫瘤體積(體積=長×寬×寬×0.52)，觀察腫瘤生長情況。所有小鼠在首次注射后第28天處死。收集裸鼠，選擇各組裸鼠代表拍照，然后將腫瘤剖出拍照，測量腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率[抑瘤率=(對照組平均體積-實(shí)驗(yàn)組平均體積)/對照組平均體積×100%]，抑瘤率≥40%并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05為有效。然后將一半腫瘤組織立即放入液氮中進(jìn)行RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測 Ang2的表達(dá)情況；另一半放入4%多聚甲醛中進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，分析腫瘤血管分布情況。

1.9 裸鼠移植瘤組織微血管密度檢測

采用免疫組織化學(xué)方法檢測移植瘤組織vWF蛋白來標(biāo)記腫瘤血管。制作腫瘤組織石蠟切片并作常規(guī)處理至抗原修復(fù)，5% BSA 封閉20 min，vWF、一抗 [艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司] 4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次后滴加生物素標(biāo)記的二抗(江蘇盈科生物制藥有限公司)，37 ℃ 孵育30 min后DAB試劑(江蘇盈科生物制藥有限公司)顯色，蘇木素復(fù)染后封片。針對vWF抗體染色行微血管密度(MVD) 計(jì)數(shù)，先在低倍鏡下(40倍和100倍)掃描切片，選擇2～3個染色密度較高的區(qū)域作為“熱點(diǎn)”區(qū)域，然后使用尼康E-400顯微鏡在200倍鏡下計(jì)數(shù)視野內(nèi)被染色的血管數(shù)。MVD定義為每高倍鏡下的血管數(shù)(HPF，×200)，取8個腫瘤標(biāo)本的平均值[22]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組Ishikawa細(xì)胞中Ang2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

a P<0.05；b P<0.001；c P>0.05A.RT-PCR檢測結(jié)果；B.蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果圖1 各組Ishikawa細(xì)胞中Ang2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組相比，Ang2 mRNA含量分別降低了76.54%、80.24%(均P<0.001)，Ang2蛋白表達(dá)量分別降低60.79%、65.09%(均P<0.001)；奧沙利鉑組與生理鹽水組比較，Ang2 mRNA和蛋白表達(dá)量分別降低了21.8%和22.9%(均P<0.05)；Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與奧沙利鉑組比較，Ang2 mRNA和蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.001)，但與Ang2敲低組比較無明顯降低(P>0.05)。

2.2 各組Ishikawa細(xì)胞凋亡率和侵襲數(shù)量檢測

各組Ishikawa細(xì)胞凋亡率分別為：生理鹽水組(8.56±1.23)%，空載質(zhì)粒組(7.90±2.32)%，奧沙利鉑組(52.13±4.14)%，Ang2敲低組(35.93±4.96)%，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組(61.55±5.03)%。奧沙利鉑組與生理鹽水組比較細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.001)；Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組比較細(xì)胞凋亡率顯著增加(均P<0.001)；Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與Ang2敲低組比較細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.001)，與奧沙利鉑組比較細(xì)胞凋亡率有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2A。

a P<0.001圖2 各組Ishikawa細(xì)胞凋亡率和侵襲數(shù)量檢測結(jié)果

各組細(xì)胞遷移數(shù)分別為：生理鹽水組80.56±4.28，空載質(zhì)粒組77.90±2.32，奧沙利鉑組20.13±4.16，Ang2敲低組38.93±4.86，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組12.55±4.96。奧沙利鉑組與生理鹽水組比較細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P<0.001)；Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組比較細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少(均P<0.001)；Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與Ang2敲低組比較細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P<0.001)，與奧沙利鉑組比較細(xì)胞遷移數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2B。

2.3 各組裸鼠皮下移植瘤在體生長情況和離體狀態(tài)下腫瘤體積及抑瘤率

裸鼠背部植入不同處理的Ishikawa細(xì)胞第7天生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質(zhì)粒組可見腫瘤出現(xiàn)，Ang2敲低組在第14天可見腫瘤出現(xiàn)，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組在第21天可見腫瘤出現(xiàn)。腫瘤植入成功率100%。在第21天時生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質(zhì)粒組瘤體直徑約10 mm，Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組瘤體直徑約4 mm和2 mm。各組處理28 d后腫瘤生長情況見圖3。各組移植瘤體積和抑瘤率見表1。Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組、Ang2敲低組、奧沙利鉑組與生理鹽水組相比腫瘤體積顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與奧沙利鉑組及Ang2敲低組相比腫瘤體積顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組、Ang2敲低組、奧沙利鉑組抑瘤率均大于40%，符合抑瘤率有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

a P<0.001A.每組的裸鼠代表；B.與 A圖裸鼠相對應(yīng)的解剖瘤體積；C.各組腫瘤體積比較圖3 各組裸鼠皮下移植瘤生長情況

表1 各組裸鼠皮下移植瘤體積及抑瘤率

2.4 各組移植瘤內(nèi)Ang2的表達(dá)和MVD

Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組比較Ang2 mRNA的表達(dá)顯著降低(均P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較Ang2 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較Ang2 mRNA表達(dá)也顯著降低(均P<0.001)，見圖4A。Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組比較Ang2 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較Ang2 蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較Ang2 蛋白表達(dá)也顯著降低(均P<0.001)，見圖4B。Ang2敲低組、Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與空載質(zhì)粒組比較MVD明顯降低(均P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較MVD明顯降低(P<0.001)，Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較MVD顯著降低(P<0.05或P<0.001)，見圖4C、表2。

表2 各組移植瘤組織中 HPF·高倍鏡-1

3 討 論

由于惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣、腫瘤的異質(zhì)性和進(jìn)化特性，個性化的精準(zhǔn)治療很難實(shí)現(xiàn)。目前抗癌的策略無非兩個方面：一是采取各種手段殺傷癌細(xì)胞；二是破壞癌細(xì)胞的生存環(huán)境。上述兩方面的聯(lián)合療法是醫(yī)學(xué)工作者的共識?；熉?lián)合抗血管生成是當(dāng)前臨床上最常用療法。在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇奧沙利鉑和Ang2 shRNA對抗Ishikawa細(xì)胞活性，這種方法有兩方面的優(yōu)勢,一是奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯(lián)合具有抗腫瘤的協(xié)同作用，二是減弱了耐藥性和毒副作用。

a P<0.05；b P<0.001A.各組移植瘤組織Ang2 mRNA含量；B.各組移植瘤中Ang2蛋白表達(dá)情況；C.各組MVD的比較圖4 各組移植瘤組織中Ang2 mRNA和蛋白表達(dá)情況及MVD

奧沙利鉑對人腫瘤細(xì)胞系，特別是順鉑耐藥細(xì)胞系具有有效的抗腫瘤活性。臨床前研究也提示奧沙利鉑脂質(zhì)體制劑具有顯著的抗血管生成活性[23]。在我們的實(shí)驗(yàn)中也證明了這一點(diǎn)：應(yīng)用小劑量奧沙利鉑治療后，奧沙利鉑組和Ang2敲低聯(lián)合奧沙利鉑組 中 Ang2無論在細(xì)胞水平還是在Ishikawa異種移植物腫瘤組織中的表達(dá)都顯著降低，特別是聯(lián)合治療組Ang2的表達(dá)更低，而且新生血管密度也明顯低于奧沙利鉑組、空載質(zhì)粒組和Ang2敲低組。Liu等[24]也發(fā)現(xiàn)低劑量奧沙利鉑對H22肝癌荷瘤小鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和MVD的表達(dá)有明顯的抑制作用，認(rèn)為低劑量奧沙利鉑在體內(nèi)可能對腫瘤組織的血管生成有抑制作用。這說明此種聯(lián)合既能抑制Ang2又能抑制VEGF的可能性。然而，上述研究結(jié)果與Fan等[25]的研究結(jié)果相矛盾，他們發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑在結(jié)腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了VEGF家族的幾個成員表達(dá)增加，包括VEGF-a、VEGF-c和PIGF。該研究未涉及在體動物實(shí)驗(yàn)，在體情況下能否誘導(dǎo)VEGF-a、VEGF-c和PlGF不太清楚，另外不同腫瘤細(xì)胞的特異性也可能會導(dǎo)致這種結(jié)果的出現(xiàn)。奧沙利鉑對不同腫瘤細(xì)胞除了發(fā)揮細(xì)胞毒性之外還有不同的作用。奧沙利鉑是否在EC細(xì)胞中對VEGF家族的幾個成員有作用，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯(lián)合具有抗血管生成的協(xié)同作用。

面對癌癥的進(jìn)化，人們一再看到新藥的有效性，隨之而來的是腫瘤耐藥，目前用于EC的抗血管生成最常用的為VEGF/VEGFR2抑制劑，但是并非所有患者都對該抑制劑有反應(yīng)，有些患者在長期使用后還是出現(xiàn)了耐藥性[26]。于是，通過恢復(fù)腫瘤的血液灌注和氧氣供應(yīng)以使腫瘤血管正?；膶W(xué)說被提出，并開始了第二代抗血管生成劑的研發(fā)，即靶向Ang/Tie 軸的藥物[27]?；谏鲜鰧W(xué)說，本實(shí)驗(yàn)采用奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯(lián)合的治療方法，一方面抑制血管的生成，另一方面使血管正?；黾訆W沙利鉑的利用效率。所以聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤生長速度非常緩慢，大大提高了抑瘤率。

另一方面，我們采用siRNA靶向Ang2的新型治療手段，siRNA幾乎沒有毒副作用，故不產(chǎn)生耐藥性[28]。所以siRNA在癌癥研究領(lǐng)域得到了前所未有的應(yīng)用。許多研究已經(jīng)使用siRNAs靶向與癌癥的起始和生長相關(guān)的基因，并表明該技術(shù)可能是在動物模型中治療癌癥的有效手段。在最近的報(bào)道中，siRNA被用來靶向胃癌細(xì)胞中的sphingosine kinase1(SphK1)、cyclin D1、survivin基因、HER-2/neu受體以及VEGF基因[29-33]。在這些研究中，siRNA的使用已經(jīng)在體內(nèi)有效地抑制了腫瘤的生長，并可能成為一種新的抗血管生成治療方法。靶向VEGF siRNA是第一個在人類臨床試驗(yàn)中用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性的例子。在小鼠身上的臨床前研究顯示，siRNA直接注射后，VEGF表達(dá)下調(diào)，新生血管生成減少[34]。我們的實(shí)驗(yàn)也獲得了與之一致的結(jié)果。

我們在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ang2 shRNA可以促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞侵襲能力，這也是移植瘤生長緩慢的一個重要原因。此結(jié)果提示Ang2可能通過某些途徑影響了Ishikawa細(xì)胞的生物學(xué)行為，這需要以后進(jìn)行深入的機(jī)制研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)證明了奧沙利鉑聯(lián)合Ang2 shRNA能有效地抑制EC細(xì)胞Ang2的表達(dá)。奧沙利鉑聯(lián)合Ang2 shRNA與單純奧沙利鉑療法相比對Ishikawa細(xì)胞的凋亡有更好的促進(jìn)作用，對細(xì)胞的侵襲能力有更明顯的抑制作用。動物模型研究進(jìn)一步證明了降低Ang2的表達(dá)可增強(qiáng)小劑量奧沙利鉑對小鼠移植瘤模型腫瘤生長和血管生成的抑制作用，是一種有希望的、新穎的、安全的、能提高化療效果的治療措施。這是一初步的研究結(jié)果，還須進(jìn)一步進(jìn)行作用機(jī)制的探討及治療效應(yīng)標(biāo)志物的檢測。