宋倩，郝一文

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院輸血科，沈陽 110001）

目前，我國臨床紅細胞輸血一般要求RhD同型，以避免發(fā)生D抗原不同導致的免疫問題。RhD陰性比例極低，是大眾熟知的“熊貓血型”。RhD基因具有豐富多態(tài)性，我國中部地區(qū)初檢RhD陰性者中約20%～30%為Del型，即極弱D或放散D［1-5］。Del型自身存在D抗原，Del型受血者或孕婦輸血時不會被D抗原致敏而產(chǎn)生D抗體［6-7］，因此不必輸注RhD陰性血而浪費RhD陰性血資源；而Del型供者則可能因攜帶的少量D抗原使RhD陰性者產(chǎn)生免疫反應，使RhD陰性者產(chǎn)生抗D抗體而使后續(xù)輸血困難。因此，對RhD陰性患者、孕婦及供者進行Del篩查具有重要意義。本研究對我科室2018年9月至2019年8月間112例初檢RhD陰性者進行Del篩查，探討Del檢測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年9月至2019年8月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院輸血科接收的初檢RhD陰性標本112例，其中內(nèi)科輸血17例，外科手術備血31例，產(chǎn)科住院者產(chǎn)前備自體血9例，門診孕婦產(chǎn)前抗體效價檢測6例，供血者49例（血液規(guī)格2 U/例）。

1.2 試劑及儀器設備

單克隆抗D（IgM+IgG）購自長春博德生物技術有限責任公司，單克隆抗D（IgG）定型血清購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司。ABO-CDE血型定型卡及Coombs微柱凝膠卡購自西班牙Diana公司。單克隆抗c、抗e血型定型試劑，抗人球蛋白試劑和不規(guī)則抗體篩查細胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司。O型RhD陽性壓積紅細胞由本實驗室配制并當日使用。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)Rh血型檢測：采用ABO-CDE微柱凝膠定型卡檢測患者血標本ABO-CDE血型表型；采用鹽水法IgM型抗c、抗e檢測c、e表型，具體步驟均按照說明書進行操作。

1.3.2 直接抗人球蛋白試驗（direct antiglobulin test，DAT）：為排除紅細胞直抗陽性對檢測結果的干擾，每例紅細胞標本均進行DAT。具體方法按說明書操作。

1.3.3 Del型檢測：利用3批次不同細胞株來源的抗D對初篩RhD抗原陰性、直抗陰性標本進行試管法間接抗人球蛋白試驗（indirect antiglobulin test，IAT），排除弱D后進行吸收放散實驗：（1）將待測壓積紅細胞和O型RhD陽性紅細胞分別與單克隆抗D（IgM+IgG）1 ∶1混勻，各實驗管均置37 ℃孵育30 min；（2）生理鹽水反復洗滌，直至取末次洗滌液與5% O型RhD陽性細胞IAT反應陰性；（3）加入等體積生理鹽水，置56 ℃放散10 min，離心1 min；（4）取放散液100 μL加入5%的O型RhD陽性紅細胞懸液50 μL，37 ℃孵育30 min；（5）洗滌3次，加抗人球蛋白試劑，離心15 s，肉眼或顯微鏡下觀察結果。

1.3.4 臨床輸血不良反應及輸血相關免疫性抗體發(fā)生情況監(jiān)測：查閱48例受血者（內(nèi)科輸血17例，外科手術備血31例）輸血記錄和住院病志，并在患者輸血后1～7 d抽取1次靜脈血進行卡式不規(guī)則抗體篩查，具體步驟按說明書進行操作。本研究取得受血者知情同意并簽署知情同意書。

2 結果

2.1 初檢RhD陰性者DAT、IAT及Del型分布結果

結果顯示，112例初檢RhD陰性者DAT和IAT均陰性。初檢RhD陰性者Del型分布見表1。

表1 112例初檢RhD陰性者Del型分布

2.2 初檢RhD陰性者的RhCE表型分布

結果顯示，35例Del型中，RhCE表型Ccee19例、CCee 11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe2例，見表2。

表2 RhCE表型分布 ［n（%）］

2.3 孕婦臨床處置

9例Rh陰性住院自體貯血孕婦中4例（含1例Del型）各采集1次全血（400 mL），5例（含3例Del型）各采集2次全血（共800 mL），在分娩中和分娩后均未回輸，血液過期報廢處理。6例門診Rh陰性孕婦（含2例Del型）孕24～32周時進行2次或3次產(chǎn)前抗體效價檢測，均未檢出Rh系統(tǒng)抗體，其中1例Del型孕婦預防注射了抗D免疫球蛋白。

2.4 初篩RhD陰性受血者血液供應、輸血不良反應及相關免疫性抗體發(fā)生情況

結果顯示，48例RhD陰性受血者（內(nèi)科輸血17例，外科手術備血31例）從提交輸血申請單到RhD陰性血液送達醫(yī)院輸血科時間為0.5～3 d，平均1.2 d。其中4例外科手術備血、1例內(nèi)科輸血患者因RhD陰性血存量有限降低了申請劑量。

12例RhD真陰性患者（內(nèi)科11例，外科1例）輸注了Del型血，其中1例內(nèi)科患者接受了2次Del型紅細胞（4 U），其余受血者均接受1次Del型紅細胞（2 U）。受血者輸血情況見表3。另外，外科中19例患者（含6例Del型，13例真陰性）手術過程失血量少、無乏氧狀態(tài)，故未輸血。48例RhD陰性受血者均未見輸血不良反應，均未產(chǎn)生抗D抗體。

表3 48例RhD陰性受血者輸血情況

3 討論

Del型在歐洲、美洲及南亞地區(qū)少見，RhD陰性人群中概率＜1%［8-10］，但在東亞地區(qū)RhD陰性人群中常見（9.1%～26.9%）［11-13］。我國Del表型常由RhD等位基因突變引起，RhD基因的第9外顯子1 227位發(fā)生G＞A堿基突變，此等位基因堿基突變?yōu)闊o義突變，但是影響mRNA正常拼接，使RhD基因表達正常Rh（D）蛋白的效率降低［6，14］。正常RhD抗原陽性紅細胞表面約有10 000～30 000個抗原表位，而Del型紅細胞膜上D抗原非常弱，表位數(shù)量可能＜30個［15］，只有通過吸收放散試驗才能檢測出來。莊乃保等［7］通過Del型與RhD蛋白質(zhì)三維結構比較，發(fā)現(xiàn)Del型膜外部分與正常RhD蛋白基本一致，即Del血型完全或基本具有正常RhD的抗原表位。因此，在輸血相容性檢測中確認RhD陰性供血者時排除Del型對確保輸血安全非常重要，同時，Del受血者則無需等待RhD陰性血液，有助于提高診療效率，節(jié)約稀有血型的血液資源。

本研究中112例初檢RhD陰性標本中Del型35例（31.3%），與西安（19.7%）［3］、武漢（24.2%）［4］、合肥（27.2%）［5］比較概率較高。孕婦中RhD陰性者是孕期產(chǎn)生RhD抗體的高風險群體。吳筱瑩等［16］研究發(fā)現(xiàn)，196例初檢陰性孕婦中，Del型占20.9%，去除Del型樣本重新統(tǒng)計，有生育史的RhD真陰性孕婦發(fā)生D抗原同種免疫反應者接近50%；研究還發(fā)現(xiàn)Del型孕婦不因妊娠和生育產(chǎn)生抗D抗體。本研究中2例（33.3%）Del型孕婦在門診期間接受了包括產(chǎn)前不規(guī)則抗體篩查及產(chǎn)前RhD抗體效價測定、RhD免疫球蛋白預防應用等處置。4例（44.4%）Del型孕婦在孕晚期采集了400～800 mL自體血?？梢?，未進行Del檢測使Del型孕婦承擔更多的醫(yī)療負擔，而RhD真陰性孕婦胎兒溶血發(fā)生概率被低估。

有研究［17］報道Del供血輸注給RhD陰性患者產(chǎn)生抗D抗體。本研究中獻血者15例Del型供者中13例輸注給了真陰性患者。12例受血者中有1例接受了2次Del型紅細胞（4 U），11例接受1次Del型紅細胞（2 U），所有患者住院期間均無輸血反應報告（受血者輸血前均未檢出不規(guī)則抗體），對受血者不規(guī)則抗體監(jiān)測時間最長1周，血清中均未檢出抗D抗體，這可能與患者輸血量和輸血次數(shù)有關。Del細胞表面D抗原數(shù)量較D陽性細胞少，患者初次抗原免疫刺激后機體約60～90 d后產(chǎn)生抗體，初次免疫產(chǎn)生抗體后再次被相應抗原刺激免疫記憶反應的抗體效價在2～3周達到峰值。另外，我國RhD陰性者基因結構有完全缺失、部分缺失和不缺失3種，RhD基因不缺失者輸入Del紅細胞不會產(chǎn)生抗D抗體［17］。

有研究［18］表明Del型與RhCE表型相關，Del型中100%RhC（+）。本研究35例Del型中RhCE表型為Ccee19例、CCee11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe 2例，RhC陽性較多（94.3%），但仍有2例為RhC陰性，說明臨床應用中根據(jù)CE表型直接排除Del型不可行。研究［2，13］顯示，隨著更多Del相關等位基因被發(fā)現(xiàn)，其對應的血清學表型不具唯一性。另外，吸收放散試驗存在一定缺陷：（1）操作過程繁瑣費時，人員操作誤差較大；（2）Del型紅細胞表面存在抗原量極少，反應強度弱容易被忽略而漏檢。

綜上所述，初檢RhD陰性人中Del型比例較高，應對初檢RhD陰性者進行Del型檢測，避免RhD陰性患者輸注Del血液而產(chǎn)生抗D抗體；如果患者為Del型，可以選擇RhD陽性血液輸注，既能保證輸血的及時性，又能節(jié)約寶貴的RhD陰性血液資源。僅憑RhCE表型不能排除Del型，血清學聯(lián)合分子生物學方法有利于檢測標準化，提高檢測準確度［12，19］。