劉經(jīng)緯，李浩，任玲，邢承忠

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽 110001）

作為調(diào)控基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可變剪接可產(chǎn)生相同RNA的不同同工型，并表達(dá)產(chǎn)生多種功能蛋白［1］。約90%的人類基因經(jīng)歷選擇性剪接事件，從而顯著增強(qiáng)人類基因組的編碼能力［2］。根據(jù)有關(guān)順式作用元件或反式作用剪接因子的信息，機(jī)體通過選擇性納入外顯子并排除內(nèi)含子信息，組裝成熟的mRNA［3］。反映轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的各種RNA亞型的多樣性受到多個(gè)選擇性剪接調(diào)節(jié)的嚴(yán)格控制，以確保在特定時(shí)間特定細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄本正確表達(dá)［4］。

研究［5］報(bào)道，與正常組織相比，癌組織中某些選擇性剪接模式失調(diào)，這表明異常的RNA剪接是癌癥的新標(biāo)志。某些選擇性剪接事件與癌癥的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［6-7］，如NUMB基因的長剪接變體可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而短剪接變體可抑制這些生物學(xué)行為，并在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮相反作用［8］。在前列腺癌中，蛋白前體加工酶PACE4基因通過選擇性剪接產(chǎn)生新的剪接變體PACE4-altCT，該剪接變體在前列腺癌中高度表達(dá)，并可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞持續(xù)增殖［9］。

癌癥中異常的可變剪接是由于癌癥相關(guān)基因的剪接元件突變或調(diào)控性剪接機(jī)制改變［10］。富含絲氨酸/精氨酸剪接因子（serine/arginine-rich splicing factor，SRSF）家族成員在mRNA的周轉(zhuǎn)、輸出和其他剪接的各種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中必不可少［11-12］。SRSF蛋白通常包括C端精氨酸-絲氨酸重復(fù)序列的RS結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)RNA識(shí)別基序。研究［13-14］報(bào)道，SRSF蛋白調(diào)控的剪接轉(zhuǎn)錄本在多種癌癥中均表現(xiàn)出促癌作用。如SRSF1水平升高導(dǎo)致CASP9和BIN1基因的選擇性剪接，產(chǎn)生促癌RNA亞型，從而干擾各種癌細(xì)胞的凋亡［15］。另外，SRSF3上調(diào)可誘導(dǎo)MCL-1基因改變，編碼在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用的同工型MCL-1L轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

了解癌變過程中異常的可變剪接，可以揭示癌癥潛在的致病機(jī)制，這將有利于改善癌癥患者的治療和預(yù)后。本研究根據(jù)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）癌癥樣本的數(shù)據(jù)，對全部癌癥中的SRSF家族進(jìn)行了全面分析，通過對一系列癌癥進(jìn)行表達(dá)和預(yù)后分析，闡明SRSF在不同癌癥的發(fā)生、預(yù)后和治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

本研究分析的結(jié)果基于TCGA（http：//cancergenome.nih.gov）生成的組學(xué)數(shù)據(jù)集。共分析33個(gè)不同的TCGA癌癥類型。所有的TCGA數(shù)據(jù)，包括表達(dá)、突變和臨床信息（生存狀態(tài)、階段、等級(jí)、生存時(shí)間），均從癌癥數(shù)據(jù)瀏覽器UCSC Xena（https：//xenabrowser.net）下載。

1.2 數(shù)據(jù)處理

首先分析不同癌癥差異表達(dá)的SRSF基因。為確定與某些途徑激活或抑制相關(guān)的SRSF基因，計(jì)算SRSF基因表達(dá)與途徑活性之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC）。為探索SRSF基因與免疫相關(guān)基因之間的相關(guān)性，計(jì)算SRSF基因表達(dá)與免疫相關(guān)基因之間的Spearman相關(guān)系數(shù)（Spearman correlation coefficient，SCC）。為探究SRSF基因的表達(dá)是否與患者生存相關(guān)，根據(jù)每個(gè)SRSF基因的中位表達(dá)，將所有患者分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，分析SRSF表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R語言Deseq2軟件包鑒定差異表達(dá)的基因。在每種癌癥類型中，將P＜ 0.05且表達(dá)至少變化2倍的基因鑒定為差異表達(dá)的基因。SRSF基因表達(dá)與通路之間的| PCC |＞ 0.3且調(diào)節(jié)后P＜ 0.05的調(diào)節(jié)子-通路被鑒定為與SRSF基因顯著相關(guān)。SRSF基因表達(dá)與免疫相關(guān)基因之間的| SCC |＞ 0.3且調(diào)節(jié)后P＜ 0.05被鑒定為與SRSF基因顯著相關(guān)。根據(jù)每個(gè)SRSF基因的中位表達(dá)，將所有患者分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，2組生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRSF基因在不同癌癥類型中的表達(dá)譜

使用TCGA的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，描述基因在不同癌癥類型中的差異表達(dá)。SRSF基因在不同癌癥類型中表現(xiàn)出異質(zhì)性分布（圖1A）。大多數(shù)SRSF在癌癥中差異表達(dá)，并且在許多癌癥中SRSF5表達(dá)下降。此外，本研究可視化SRSF12在每種癌癥中的差異表達(dá)（圖1B）。

圖1 不同癌癥類型的SRSF基因表達(dá)譜Fig.1 SRSF expression profile in different cancer types

2.2 SRSF基因的全癌基因變異

SRSF基因的突變頻率分析結(jié)果表明，大多數(shù)SRSF基因在子宮內(nèi)膜癌中經(jīng)常發(fā)生突變（圖2A）?？傮w平均突變頻率范圍為0%～11.1%，包括SFSF11、SRSF6、SRSF5在內(nèi)的SRSF基因具有較高的突變頻率。為了顯示有關(guān)SRSF突變的更多詳細(xì)信息，本研究通過oncoplot可視化子宮內(nèi)膜癌中SRSF基因的詳情突變情況（圖2B）。

2.3 SRSF與癌癥免疫狀態(tài)的相關(guān)性

SRSF與癌癥相關(guān)通路關(guān)系的分析（圖3A）結(jié)果表明，SRSF表達(dá)與各種致癌途徑的激活或抑制顯著相關(guān)。說明SRSF基因主要參與癌癥相關(guān)通路，包括G2/M檢查點(diǎn)、DNA修復(fù)、白細(xì)胞介素-2（interleukin 2，IL-2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、缺氧和KRAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。總結(jié)每個(gè)基因的相關(guān)通路數(shù)，結(jié)果表明，SRSF1、SRSF3、SRSF9和SRSF11更可能與致癌過程有關(guān)（圖3B）。

2.4 SRSF基因的預(yù)后意義

通過Cox回歸分析SRSF基因在不同癌癥類型中的預(yù)后意義（圖4A）。在包括腎上腺皮質(zhì)癌和肝細(xì)胞癌在內(nèi)的癌癥中，大多數(shù)SRSF與癌癥患者的生存期較差有關(guān)。相反，SRSF能夠預(yù)測某些癌癥如胸腺癌的預(yù)后較好。此外，某些SRSF基因如SRSF12和SRSF1可能會(huì)在不同癌癥類型中發(fā)揮明顯的不同預(yù)后作用。因此，本研究通過森林圖說明SRSF基因在不同癌癥類型中特定的預(yù)測結(jié)果（圖4B）。

3 討論

近年來，越來越多的證據(jù)表明，RNA選擇性剪接調(diào)節(jié)因子可能充當(dāng)癌基因或抑癌基因，通過產(chǎn)生關(guān)鍵途徑的某些RNA亞型而導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。選擇性剪接的異常調(diào)節(jié)是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵過程，并為多種癌癥提供了潛在的、豐富的、新的治療靶標(biāo)和生物標(biāo)志物。通過全面分析TCGA中SRSF基因家族數(shù)據(jù)，本研究探討了不同癌癥類型中SRSF的表達(dá)、突變及其對預(yù)后的影響。結(jié)果表明，SRSF基因家族與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。

使用TCGA的數(shù)據(jù)，本研究描述了SRSF基因在不同癌癥類型中的表達(dá)。SRSF在大多數(shù)癌癥中存在差異表達(dá)，并且SRSF基因在不同癌癥類型中表現(xiàn)出異質(zhì)性分布，表明SRSF顯著參與了癌癥的發(fā)展。已有研究報(bào)道，與非癌組織相比，肺癌組織中SRSF5、SRSF6和SRSF7表達(dá)顯著增加。SRSF5可能成為小細(xì)胞肺癌和胸膜轉(zhuǎn)移癌新的生物標(biāo)志物。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，SRSF1可以與NEAT1相互作用，并促進(jìn)NEAT1 RNA的穩(wěn)定性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成。此外，SRSF1和SRSF9以mTOR基因依賴的模式，通過促進(jìn)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子β-catenin的生物合成來促進(jìn)癌變。

圖2 SRSF基因的全癌基因改變Fig.2 Pan-cancer alterations in SRSF

圖3 SRSF基因與癌癥相關(guān)途徑和免疫狀態(tài)的相關(guān)性Fig.3 Associations of SRSF genes with cancer-related pathways and immune status

圖4 SRSF基因的預(yù)后意義Fig.4 Prognostic values of SRSF genes

突變分析結(jié)果提示，大多數(shù)SRSF基因在子宮內(nèi)膜癌中經(jīng)常發(fā)生突變。有研究提出，子宮內(nèi)膜癌代表突變頻率較高的癌癥類型。包括SFSF11、SRSF6、SRSF5在內(nèi)的SRSF基因具有較高的突變頻率，結(jié)腸癌、宮頸鱗癌和腺癌、直腸癌等表現(xiàn)出明顯的SRSF基因突變。

SRSF的表達(dá)與各種致癌途徑的激活或抑制顯著相關(guān)，包括G2/M檢查點(diǎn)、DNA修復(fù)、IL-2/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、缺氧和KRAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，SRSF可能通過影響癌細(xì)胞的核心生物學(xué)過程（如DNA修復(fù)和細(xì)胞周期）來參與癌癥的調(diào)控。SRSF基因中，SRSF1、SRSF3、SRSF9和SRSF11更可能與致癌過程有關(guān)，這些SRSF基因在癌癥中的作用可能成為未來新的研究方向。

本研究通過Cox回歸分析了SRSF基因在不同癌癥類型中的預(yù)后意義。多個(gè)SRSF基因都與癌癥患者預(yù)后較差相關(guān)，但也存在一些SRSF與癌癥預(yù)后較好相關(guān)，這提示SRSF在不同癌癥中的作用可能存在差異。且同一SRSF基因也可能對不同癌癥的預(yù)后作用不同，這提示SRSF發(fā)揮作用的復(fù)雜性。SRSF基因在預(yù)測癌癥預(yù)后方面具有廣闊的潛力。

綜上所述，本研究系統(tǒng)證明了SRSF基因在一系列癌癥中的表達(dá)、突變、功能通路和預(yù)后價(jià)值。SRSF的表達(dá)與致癌途徑包括G2/M檢查點(diǎn)、DNA修復(fù)、IL-2/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、低氧和KRAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著相關(guān)。通過評估SRSF基因狀態(tài)可以預(yù)測癌癥患者的預(yù)后。這些發(fā)現(xiàn)為未來改善癌癥發(fā)展和治療提供了新的證據(jù)。