李坤航，張旭東，趙丹，梁宇，鐘詩雨，趙偉東，包義君

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110032；2.生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育細胞生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內(nèi)最主要的致死和致殘原因［1］。在中國，每10萬人中有13人因腦損傷而死亡［2］。TBI顯著增加其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病風(fēng)險，包括慢性創(chuàng)傷性腦病、阿爾茨海默病和抑郁等［3］，從而帶來巨大社會壓力和經(jīng)濟損失［2］。腦血管損傷是TBI重要的病理生理過程，腦血管結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙參與了TBI的發(fā)病、發(fā)展及損傷修復(fù)過程，并與繼發(fā)性損傷密切相關(guān)。血管功能障礙常表現(xiàn)為腦出血、腦梗死、腦水腫等［4］。腦血流是評估血管功能的重要指標之一，大多數(shù)TBI患者在受傷后可以觀察到局部或整體的腦血流減少，進一步導(dǎo)致缺血性腦損傷，這是TBI后死亡的主要原因［5］。但是，關(guān)于腦血流的恢復(fù)及其與運動功能的相關(guān)性研究很少。輕中度腦損傷后，腦血流通常會幾周內(nèi)恢復(fù)正常［4］，早期干預(yù)和合理調(diào)節(jié)腦血流可能會改善TBI患者的預(yù)后。

本研究旨在明確TBI后腦血流的動態(tài)變化過程，探討腦血流變化與運動功能的相關(guān)性，為通過調(diào)節(jié)腦血流改善TBI患者的預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用84只12 h/12 h光/暗飼養(yǎng)的成年雄性C57BL/6野生型小鼠，體質(zhì)量25～30 g，12周齡（遼寧長生生物科技有限公司）。所有實驗在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理監(jiān)督下，符合動物福利和倫理準則。將小鼠隨機分為Sham組和TBI組，每組42只。實驗過程中無小鼠死亡，實驗后給予小鼠安樂死。

1.2 方法

1.2.1 控制性皮質(zhì)撞擊（controlled cortical impact，CCI）損傷模型建立：采用CCI設(shè)備［6］（Pinpoint 精確皮層撞擊器PCI3000，美國Hatteras 公司）構(gòu)建TBI模型。CCI具有較強的可操作性和較高的準確性，可控制撞擊參數(shù)（撞擊速度、撞擊深度和停留時間）以獲得不同程度腦損傷，并通過評估小鼠神經(jīng)功能和腦損傷深度判定TBI程度。TBI后小鼠神經(jīng)功能輕度下降而無腦組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)檩p度；TBI后小鼠神經(jīng)功能明顯下降且腦損傷僅累及皮層未傷及海馬為中度；TBI后小鼠神經(jīng)功能明顯下降且腦損傷累及海馬或更深層腦組織為重度［7］。

小鼠用異氟烷麻醉后，將其頭部固定在立體定位架中，恒溫加熱墊維持體溫。術(shù)區(qū)消毒后，在頭皮上做一個長約10 mm的正中切口，剝離皮膚和骨膜，在右頂骨上，以矢狀縫右側(cè)和冠狀縫后側(cè)3 mm處為中心，用顱鉆鉆開直徑4 mm的圓形骨窗（圖1A）。TBI組小鼠在接受開顱手術(shù)后，選擇直徑3 mm的圓形鋼制平頭撞擊器，撞擊器接觸硬腦膜后（圖1B），以1.5 m/s的撞擊速度、1.0 mm的撞擊深度垂直撞擊腦皮層，撞擊后停留50 ms?？p合皮膚，喚醒小鼠。Sham組小鼠只接受開顱手術(shù)，不進行撞擊。

1.2.2 激光散斑成像：使用激光散斑血流成像系統(tǒng)［8］（SIM BFI-HR，PRO迅微光電科技有限公司）測量腦血流量。分別于TBI前和TBI后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、35 d對造模成功的小鼠進行激光散斑成像。成像在恒溫麻醉下進行，剪開前期縫合皮膚，暴露顱骨并清洗。在圖像采集過程中，使用無菌棉保持曝光區(qū)域清潔干燥。在可見光下調(diào)整CCD攝像機焦距以獲得清晰圖像，之后轉(zhuǎn)換到785 nm激光狀態(tài)下采集腦血流信號，用LSCI軟件（SIM BFI軟件，光電科技有限公司）轉(zhuǎn)換成腦血流圖像。每隔1 s采集1張圖像，共采集20幅圖像。通過LSCI軟件對采集的腦血流圖像進行分析，在小鼠腦左右對稱的固定位置，選取面積50 mm2圓形觀察區(qū)域，LSCI軟件自動計算并生成觀察區(qū)域平均血流指數(shù)（blood flow index，BFI）。通過計算損傷側(cè)和損傷對側(cè)腦血流的相對變化分析TBI后腦血流的動態(tài)改變，腦血流相對變化的計算公式：腦血流相對變化（%）=（損傷側(cè)BFI-對側(cè)BFI）/對側(cè)BFI×100。

1.2.3 轉(zhuǎn)棒實驗：采用轉(zhuǎn)棒實驗評估小鼠運動協(xié)調(diào)性（ZB-200，成都泰盟軟件有限公司）。首先在TBI前第3天開始對小鼠進行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔為10 min，轉(zhuǎn)棒速度為20 r/min，使小鼠在300 s內(nèi)基本能夠隨轉(zhuǎn)棒做相應(yīng)運動，避免在轉(zhuǎn)棒上失去平衡而掉落。以TBI前第1天跌落時間為基線。然后分別于TBI后第1、3、5、7、10、14、21、28、35天進行實驗，在20 r/min轉(zhuǎn)棒速度下記錄小鼠跌落時間，未跌落最長實驗時間設(shè)為300 s，每次實驗進行3次，間隔10 min，將3次跌落時間均值記錄為每次跌落時間。

1.2.4 懸繩實驗：將小鼠以懸臂狀態(tài)放在長30 cm、直徑2 mm的懸繩上，然后被釋放。每只小鼠測試3次，根據(jù)缺陷嚴重程度進行評分（0～3分）。小鼠立即從懸繩掉落，記為3分；2只前爪都掛在繩子上，試圖爬到繩子上，記為2分；2只前爪和1只或2只后爪都在繩子周圍，記為1分；4只爪子和尾巴在繩子周圍，有橫向移動，記為0分。

1.2.5 壁架實驗：將小鼠放在高35 cm、寬0.8 cm的籠子壁架上，監(jiān)測其運動情況。每只小鼠測試3次，根據(jù)缺陷嚴重程度進行評分（0～3分）。小鼠從壁架上摔下來或拒絕行走，記為3分；小鼠沒有立即有效地在壁架上行走或從壁架上下來，記為2分；小鼠在壁架上行走時表現(xiàn)出腳部障礙，記為1分；小鼠沿著壁架行走，沒有腳部障礙（即松腳），然后小心翼翼地回到籠子里，記為0分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)值均以表示，2組比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 21.0軟件進行Pearson相關(guān)分析和曲線擬合。

2 結(jié)果

2.1 小鼠中度TBI模型的構(gòu)建

TBI造模（圖1A、1B）后，腦組織出現(xiàn)出血和挫裂傷等表現(xiàn)（圖1C）。通過腦組織冠狀切片評估腦損傷區(qū)域，確認腦損傷僅局限于皮層未傷及海馬（圖1D），達到中度TBI模型標準。

圖1 構(gòu)建小鼠中度TBI模型Fig.1 Establishment of a mouse model of moderate traumatic brain injury（TBI）

2.2 TBI后腦血流的動態(tài)變化

通過激光散斑技術(shù)量化TBI后局部腦血流變化，分別在小鼠腦左右對稱固定位置選取感興趣區(qū)域進行數(shù)據(jù)采集（圖2A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TBI急性期損傷區(qū)域腦血流顯著減少，TBI后6 h、1 d、3 d腦血流分別減少了69.8%、62.9%、67.8%（圖2B、2C）。TBI后3 d腦血流開始恢復(fù)，TBI后7 d腦血流雖然有所恢復(fù)，但仍減少了45.2%，直至TBI后14 d基本恢復(fù)到正常水平（圖2B、2C）。

圖2 TBI后腦血流的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in cerebral blood flow（CBF）after traumatic brain injury（TBI）

2.3 TBI后小鼠運動行為學(xué)的變化

轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果表明，TBI導(dǎo)致運動障礙，TBI后小鼠轉(zhuǎn)棒時間明顯下降至14.3 s，TBI后3 d下降至最低點13.5 s，之后運動能力逐漸恢復(fù)，TBI后5 d、7 d、10 d、14 d、21 d分別為79.6 s、141.4 s、193.8 s、263.0 s、286.0 s，直至TBI后28 d運動協(xié)調(diào)能力恢復(fù)正常（圖3A）。懸繩實驗結(jié)果表明，TBI后1 d評分顯著增加，提示前肢肌力明顯受損，TBI后14 d受損肌力大部分恢復(fù)。壁架實驗也得到相似結(jié)果，TBI后評分顯著增加，提示四肢協(xié)調(diào)能力下降，并于TBI后14 d基本恢復(fù)正常（圖3B）。

圖3 TBI后運動功能的變化Fig.3 Impaired motor function after traumatic brain injury（TBI）

2.4 TBI后腦血流動態(tài)恢復(fù)與行為學(xué)變化的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，TBI后小鼠腦血流動態(tài)恢復(fù)和行為能力恢復(fù)呈顯著正相關(guān)（r=0.984，P＜ 0.01）。TBI后當腦血流減少時，小鼠行為能力下降；當腦血流恢復(fù)時，小鼠行為能力也逐漸改善（圖4A）。以小鼠轉(zhuǎn)棒實驗中跌落時間改變量百分比為因變量（Y），以腦血流改變量百分比為自變量（X），繪制散點圖（圖4B），根據(jù)圖形趨勢再進行Pearson直線相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)2組變量呈線性相關(guān)（F=124，P=0.000 4）。Pearson直線回歸方程初步建立為Y=1.307X-5.744。

圖4 TBI后腦血流變化和行為能力變化的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of cerebral blood flow（CBF）and motor function after traumatic brain injury（TBI）

3 討論

TBI常導(dǎo)致腦血管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，繼而誘發(fā)血管痙攣、閉塞等改變，從而影響腦血流，腦血流變化后出現(xiàn)腦缺血、出血、外滲等現(xiàn)象，這些繼發(fā)性改變會再次影響腦血流。無論是原發(fā)性還是繼發(fā)性腦血流變化，都會導(dǎo)致腦損傷，引起神經(jīng)功能障礙［4，9］。TBI后，腦組織損傷大小、位置、類型以及損傷時間都會影響腦血流變化的形式和程度［9］。HAYWARD等［10］發(fā)現(xiàn)，患者遭受中度或重度TBI后，腦血流出現(xiàn)嚴重障礙，隨后緩慢恢復(fù)到生理水平。他們還通過灌注加權(quán)磁共振成像發(fā)現(xiàn)大鼠TBI后6 h同側(cè)皮質(zhì)腦血流減少，隨后24 h腦血流增加，TBI后2～14 d腦血流長期下降。在小鼠TBI模型中也觀察到相似現(xiàn)象。ABRAHAMSON等［11］通過CCI模型發(fā)現(xiàn)，小鼠TBI后3周內(nèi)皮質(zhì)挫傷區(qū)腦血流一直保持低灌注狀態(tài)；而丘腦血流在TBI后3 d開始恢復(fù)，在TBI后3周基本恢復(fù)至正常水平；海馬區(qū)血流在TBI后無明顯改變。然而，以往研究無論是在患者還是在動物模型中，均是對幾個孤立時間點的腦血流檢測。而本研究首次持續(xù)動態(tài)監(jiān)測小鼠TBI后腦血流變化，即TBI急性期局部腦血流顯著下降，減少了60%～70%，TBI后6 h下降程度最大，減少了69.8%。TBI后3 d腦血流逐漸恢復(fù)，TBI后7 d仍呈低灌注狀態(tài)，至14 d恢復(fù)至正常水平。本研究構(gòu)建了小鼠腦額葉運動區(qū)皮層中度TBI模型，完整記錄TBI后超急性期（TBI后6 h）、急性期（TBI后3 d）、亞急性期（TBI后3周）及恢復(fù)期腦血流從減少到恢復(fù)的實時動態(tài)變化全過程。本研究的連續(xù)性血流分析更有利于指導(dǎo)后期腦血流調(diào)節(jié)治療，為后期臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

腦血流的平衡與穩(wěn)定是維持正常神經(jīng)功能的前提，腦血流改變會引起神經(jīng)功能障礙。LEISTNER等［12］在對中風(fēng)兒童的研究中發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)患者重要組織中腦血流明顯低于同齡人。與非偏癱患者相比，偏癱患者腦血流灌注不平衡，特別是在運動區(qū)。INOUE等［13］發(fā)現(xiàn)，重度TBI患者中腦血流恢復(fù)好的患者，其神經(jīng)功能狀態(tài)預(yù)后要明顯好于腦血流無明顯恢復(fù)者。JING等［6］發(fā)現(xiàn)，TBI導(dǎo)致小鼠在急性期病變部位腦血流減少，然后逐漸恢復(fù)，至TBI后28 d恢復(fù)至正常水平，隨后神經(jīng)認知功能改善。本研究發(fā)現(xiàn)，腦血流與運動功能恢復(fù)呈顯著正相關(guān)。TBI導(dǎo)致小鼠運動協(xié)調(diào)能力顯著下降，尤其在TBI后3 d最差，與腦血流在TBI后3 d略有下降相對應(yīng)，隨著腦血流恢復(fù)而逐漸改善。本研究發(fā)現(xiàn)，當腦血流在TBI后14 d已恢復(fù)到正常水平時，運動功能仍存在缺陷，直到TBI后28 d恢復(fù)到正常水平，這說明腦血流恢復(fù)早于運動功能恢復(fù)，提示腦血流恢復(fù)是神經(jīng)功能恢復(fù)的前提與保障。本研究首次提出腦血流恢復(fù)是運動功能恢復(fù)的必要條件，所以早期選擇適當時間點通過高壓氧或藥物等干預(yù)因素促進腦血流恢復(fù)可能會改善TBI神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究建立的TBI模型模擬的是中等程度的TBI，在其他不同程度（如輕度和重度）的TBI模型中，腦血流和運動功能變化的相關(guān)性是否與本研究一致，有待于進一步研究。

綜上所述，TBI可導(dǎo)致腦血流下降和運動功能障礙，隨后腦血流和運動功能逐漸恢復(fù)，二者的恢復(fù)呈顯著正相關(guān)，且腦血流的恢復(fù)早于運動功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，臨床工作中可通過TBI患者腦血流恢復(fù)情況提早預(yù)測運動功能恢復(fù)情況；同時，采取措施促進腦血流恢復(fù)，可能會促進患者運動功能的恢復(fù)。