張明慧，李彥姝

（中國醫(yī)科大學 1.臨床醫(yī)學系；2.生命科學學院分子細胞生物學教研室，教育部醫(yī)學細胞生物學重點實驗室暨衛(wèi)健委細胞生物學重點實驗室，沈陽 110122）

LMO2基因首次發(fā)現(xiàn)于急性T淋巴細胞白血?。╝cute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）患者［1］，作為核轉(zhuǎn)錄因子促進胚胎造血與血管的生成［2］。研究［3］表明，LMO2可在多種實體組織和腫瘤中的細胞質(zhì)和細胞核表達。LMO2蛋白僅由2個串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域組成，在LDB1、GATA1、TAL1和E47構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄復合物中起橋梁作用［4］。乳腺癌是全世界女性癌癥死亡的主要原因［5］，也是目前中國女性最常見的癌癥。2014年中國新增乳腺癌病例估計數(shù)約為28萬例，因乳腺癌死亡人數(shù)約為6.6萬［6］。

無論在正常的乳腺導管上皮還是乳腺癌細胞中，LMO2均主要表達在胞質(zhì)中。通過阻斷LIMK1介導的CFL1磷酸化，LMO2促進板狀足/絲足的組裝形成，進而增加基底型乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［7-8］。此外，LMO2通過與DVL-1/2蛋白結(jié)合，減弱Wnt信號通路中β-catenin激活，因此，LMO2在乳腺癌細胞中的表達下調(diào)可促進細胞增殖，減少凋亡［9］。

本研究通過生物信息學分析LMO2 在乳腺癌中的表達以及LMO2及其共表達基因在乳腺癌中的生物學作用，有望為臨床以LMO2基因為靶點的乳腺癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究數(shù)據(jù)來源于Oncomine數(shù)據(jù)（http：//www.oncomine.org/resource），基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn），人類蛋白質(zhì)圖譜（human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（http：//www.proteinatlas.org/），KM plotter 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/），Coexpedia 數(shù)據(jù)庫（http：//www.coexpedia.org/）和FunRich 3.1.3.軟件。

1.2 數(shù)據(jù)提取

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫：腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫與集成數(shù)據(jù)挖掘平臺，包含65個基因表達數(shù)據(jù)集，可提供腫瘤和正常組織的基因差異表達分析［10］。篩選條件為（1）gene：LMO2；（2）cancer type：breast cancer；（3）data type：mRNA；（4）analysis type：cancer vs normal analysis；（5）臨界值設(shè)定為P＜ 0.01，fold change＞2，gene rank=top10% 。

1.2.2 HPA數(shù)據(jù)庫：免疫組織化學數(shù)據(jù)的公共存儲庫，該數(shù)據(jù)庫測定了蛋白在正常組織、細胞以及腫瘤病理組織的表達。篩選條件為（1）search：LMO2；（2）type：tissue atlas：breast caner；（3）分別選擇“tissue”“pathology”，組織來源為“female organs：breast”。

1.2.3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫：分析來自TCGA和GTEx的數(shù)據(jù)，提供關(guān)鍵的交互式和可定制的功能，包括差異表達分析、剖面繪制、相關(guān)性分析、患者生存分析、相似基因檢測和降維分析［11］，分析LMO2在乳腺癌與正常組織中表達的水平。篩選條件為（1）Expression DIY：Box plot；（2）gene：LMO2；（3）data selection：BRCA。其他設(shè)為默認值。

1.2.3.1LMO2基因在腫瘤組織中的表達差異分析（1）cancer type analysis：differential genes analysis；（2）dataset：BRCA；（3）differential methods：LIMMA。

1.2.3.2 相關(guān)性分析 篩選條件為（1）correlation analysis；（2）gene A：LMO2，gene B：GIMAP6、TGFBR2、LHFP、PTPRB、CAV1；（3）Dataset selection：BRCA Tumor。

1.2.4 KM plotter 數(shù)據(jù)庫：采用包括乳腺癌在內(nèi)多種癌癥的基因表達和生存數(shù)據(jù)構(gòu)建的在線數(shù)據(jù)庫，評估LMO2在乳腺癌患者中的預后價值。篩選條件為（1）選 擇：Breast cancer；（2）gene：LMO2；（3）Split patients by：Auto select best cutoff；（4）Survival：分 別選擇“OS”“PPS”“RFS”。

1.2.5 Coexpedia數(shù)據(jù)庫：通過功能關(guān)聯(lián)進行評估的共表達［12］，對 LMO2進行在乳腺癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。篩選條件為（1）Submit：Human LMO2；（2）MeSH incl.Neoplasms：Breast Neoplasms。

1.2.6 FunRich 3.1.3.軟件：進行基因注釋分析，分別顯示LMO2及共表達基因的細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）、信號通路（biological pathway，BPA）。篩選條件：（1）Add dataset：輸入LMO2和通過Coexpedia獲得的Score＞3 的14個基因；（2）gene enrichment：analysis：Cellular component、Molecular function、Biological process、Biological pathway；（3）臨界值設(shè)定為P＜ 0.05。

1.2.7 R包 clusterProfiler：用作LMO2及其共表達的關(guān)鍵基因京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。富集顯著性的閾值設(shè)定為P＜ 0.05。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用數(shù)據(jù)庫默認的統(tǒng)計學分析方法。乳腺癌與正常乳腺組織中 LMO2表達的比較采用單因素方差分析；LMO2與其關(guān)鍵基因的表達相關(guān)性采用Pearson分析；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，LMO2高、低表達組生存率的比較采用 log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LMO2基因在常見腫瘤組織中的基因表達

對 Oncomine 數(shù)據(jù)庫進行檢索分析后共納入涉及LMO2基因相關(guān)性研究結(jié)果 453 項，挑選出高表達7項和低表達 41項差異有統(tǒng)計學意義的結(jié)果進一步分析。腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高表達2項；乳腺癌中低表達4項；結(jié)直腸癌中低表達6項；食管癌中低表達2項；頭頸癌中低表達2項；白血病中低表達6項；肺癌中低表達14項；淋巴瘤中低表達2項；黑色素瘤中低表達2項。見圖1。

圖1 LMO2基因在多種腫瘤中的表達Fig.1 LMO2 gene expression in multiple tumors

2.2 LMO2在乳腺癌中的表達

在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中對乳腺癌（1 197例），乳腺癌組織（1 085例）及正常組織（112例）在mRNA水平上的表達情況進行比較，結(jié)果表明，LMO2在乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于正常組織，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 LMO2基因表達水平在乳腺癌中明顯低于正常乳腺組織Fig.2 LMO2 gene expression levels are significantly lower in breast cancer than in normal breast tissue

2.3 LMO2蛋白在正常乳腺組織與乳腺癌組織中的表達

HPA 數(shù)據(jù)庫中的免疫組化染色結(jié)果證實，LMO2蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯低于正常乳腺組織。且乳腺癌患者病理組織中LMO2主要定位于細胞質(zhì)或細胞膜。見圖3。

圖3 乳腺癌中LMO2蛋白表達水平低于正常乳腺組織Fig.3 LMO2 protein expression levels are lower in breast cancer than in normal breast tissue

2.4 LMO2在乳腺癌中的臨床預后價值

采用 KM plotter 數(shù)據(jù)庫評估LMO2的表達水平對腫瘤患者總生存期（overall survival，OS）的影響，提示低表達水平的LMO2 在乳腺癌中預示更差的總生存期（P=0.002 2）。進一步分析結(jié)果顯示，LMO2低表達同樣預示著乳腺癌患者更差的后進展生存期（post progression survival，PPS）（P=0.045）和 更差的無復發(fā)生存期（release free survival，RFS）（P＜0.001）。見圖4。

圖4 LMO2在乳腺癌患者中的預后價值Fig.4 The prognostic value of LMO2 in breast cancer patients

2.5 LMO2在乳腺癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

本研究利用Coexpedia數(shù)據(jù)庫篩選出LMO2基因在乳腺癌中調(diào)控的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到LMO2的共表達基因共47個。其中score＞ 3的共表達基因有14個：ADGRL4、GIMAP6、PECAM1、TGFBR2、MEF2C、CD93、S1PR1、LHFP、GMFG、A2M、LDB2、KCTD12、PTPRB和CAV1。見圖5 。

2.6 LMO2及其共表達基因的注釋分析

采用 Funrich軟件進行基因注釋分析，細胞組成方面，8個基因主要分布在細胞膜，基因占比57.14%（P＜ 0.010）。分子功能方面分別在受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、補體活性、受體信號蛋白酪氨酸磷酸酶活性起著重要作用。生物學過程方面，7個基因在信號傳導方面起著重要作用，基因占比46.67%（P=0.028）。信號通路方面，可能參與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）受體信號轉(zhuǎn)導、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換等多種通路。見表1～4。

表1 LMO2共表達基因的細胞組成Tab.1 Subcellular localization of LMO2 co-expressed genes

表2 LMO2共表達基因的分子功能Tab.2 Molecular functions of LMO2 co-expressed genes

表3 LMO2共表達基因的生物學過程Tab.3 Biological processes mediated by LMO2 co-expressed genes

表4 LMO2共表達基因的信號通路Tab.4 Biological pathways occupied by LMO2 co-expressed genes

2.7 關(guān)鍵基因的差異性分析、相關(guān)性分析與KEGG富集分析

為了驗證上述14個關(guān)鍵基因是否在乳腺癌中存在差異性表達，采用GEPIA進行差異基因篩選，篩選出在乳腺癌與正常組織之間有顯著差異表達的基因3 559個，見圖6。

圖5 LMO2在乳腺癌中的共表達分子網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of LMO2 co-expressed molecules in breast cancer

14個基因中，表達顯著上調(diào)的基因為CAV1（FC=1.008，P＜ 0.001），表達顯著下調(diào)的基因有GIMAP6（FC=-1.142，P＜ 0.001）、TGFBR2（FC=-1.373，P＜0.001）、LHFP（FC=-1.075，P＜ 0.001）和PTPRB（FC=-1.537，P＜ 0.001）。見表5。

表5 LMO2的關(guān)鍵基因在乳腺癌及正常組織中的表達水平Tab.5 Expression levels of LMO2 hub genes in breast cancer and normal tissues

通過GEPIA進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，LMO2在mRNA的表達水平與GIMAP6、TGFBR2、LHFP、PTPRB和CAV1等基因的mRNA表達呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)性系數(shù)r分別為 0.51、0.46、0.52、0.48、0.43。見圖7。

對LMO2、GIMAP6、TGFBR2、LHFP、PTPRB和CAV1進行 KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，上述6個基因富集于黏附連接、腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)、細胞內(nèi)吞等通路。見圖8。

3 討論

過去LMO2被認為在胚胎造血以及血管生成中起著重要作用，并通過不同的致癌機制驅(qū)動T-ALL形成［13］。在造血細胞和內(nèi)皮細胞中，LMO2主要分布在細胞核內(nèi)，而在上皮細胞和實體瘤細胞中則分布在細胞質(zhì)內(nèi)［9］。無論是在細胞核還是細胞質(zhì)中，LMO2都發(fā)揮著復雜的功能。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子時，LMO2主要通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用并定位到DNA的結(jié)構(gòu)域上，參與下游靶基因的調(diào)控［14］。而存在于細胞質(zhì)時，LMO2作為癌基因或腫瘤抑制因子，與其他蛋白結(jié)合參與腫瘤的發(fā)病過程［15］。

圖6 染色體上乳腺癌差異性表達基因Fig.6 Differentially expressed genes in breast cancer mapped to chromosomes

圖7 LMO2與核心基因表達的相關(guān)性Fig.7 Correlation between LMO2 and expression of core genes

圖8 LMO2與核心基因的KEGG富集分析Fig.8 KEGG pathways enriched with LMO2 and core genes

本研究通過Oncomine分析LMO2在各腫瘤中的表達情況。在有統(tǒng)計學意義的4項乳腺癌的研究中，LMO2集中表達高、低均有報道，可能與乳腺癌的不同亞型及樣本量大小有關(guān)。利用GEPIA及HPA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)LMO2在乳腺癌組織中轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平均低于正常組織。此外，低表達LMO2預示著乳腺癌患者更差的OS。這些進一步提示LMO2可能在乳腺癌的發(fā)病過程中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，同時可以作為預后指標預測乳腺癌患者生存。

為了清楚LMO2參與調(diào)控哪些分子生物學網(wǎng)絡(luò)，采用 Coexpedia數(shù)據(jù)庫挖掘，并應(yīng)用FunRich 3.1.3.軟件著重分析score＞3 的LMO2共表達基因，分析其中的分子功能和生物學過程作用。如ADGRL4、GIMAP6和PECAM等基因參與信號轉(zhuǎn)導通路的建立，TGFBR2參與細胞增殖的調(diào)節(jié)，這些基因均可能在乳腺癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中與LMO2基因發(fā)揮重要作用。

進一步探究這些與LMO2關(guān)系密切的基因在乳腺癌和正常人群中是否呈差異性表達，結(jié)果顯示，GIMAP6、TGFBR2、LHFP和PTPRB4個基因與LMO2相同，在乳腺癌中呈低表達，而CAV1基因則相反，呈高表達。其中GIMAP6、LHFP和CAV1參與上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mensenchymal transition，EMT），EMT是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動因素，研究［16］已證明EMT的激活是產(chǎn)生癌癥干細胞的主要機制。此外，TGFBR2與CAV1共同參與 TGF-β受體信號通路，TGF-β在乳腺癌早期起增殖抑制和凋亡誘導作用，在晚期可促進腫瘤的侵襲［17］。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LMO2與GIMAP6、TGFBR2、LHFP、PTPRB和CAV1的表達均有明顯的相關(guān)性。KEGG分析表明，這些基因富集于黏附連接、腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)等通路，表明LMO2很可能與這些基因相互作用，共同參與乳腺癌的癌變、侵襲、轉(zhuǎn)移。

乳腺癌是一種多因素、異質(zhì)性疾病，需要臨床敏銳性和多學科的診斷和治療方法。本研究對多個腫瘤數(shù)據(jù)庫進行挖掘，明確了LMO2基因在乳腺癌中轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平均下降。通過生物信息分析學技術(shù)發(fā)掘在乳腺癌發(fā)病過程中有潛在研究價值的重要基因，以及乳腺癌與正常組織間的差異表達基因，并對這些關(guān)鍵基因進行細胞組成、分子功能、生物學過程及信號通路等方面的注釋，能夠為臨床上乳腺癌的治療提供新靶點。