王夢(mèng)茜，金 燚，夏 凡，俞 靜，丁國(guó)憲

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

內(nèi)臟肥胖與胰島素抵抗、2 型糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)，更是一種“慢性低度炎癥性疾病”，是心腦血管疾病的罪魁禍?zhǔn)祝?］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，11β?羥類(lèi)固醇脫氫酶（11β?hydroxysteroid dehydrogenase，11β?HSD1）的升高與內(nèi)臟肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。作為一種廣泛的、高度可調(diào)控的酶，11β?HSD1是糖皮質(zhì)激素作用的放大器，在人體內(nèi)可催化無(wú)活性的可的松變成有活性的氫化可的松［2］。11β?HSD1 水平的升高導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素活性增加，進(jìn)而產(chǎn)生內(nèi)臟肥胖、高血壓、血脂紊亂、胰島素抵抗等［3］。

腸道是人體營(yíng)養(yǎng)吸收的主要器官［4］，同時(shí)又是抵御化學(xué)物質(zhì)和病原侵襲的第一細(xì)胞屏障和免疫防御組織，因而在營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫反應(yīng)中均起到重要的調(diào)節(jié)作用。肥胖不僅導(dǎo)致腸道微生物紊亂，還可通過(guò)緊密連接蛋白的破壞使腸道通透性增加，細(xì)菌內(nèi)毒素穿透腸道，引起機(jī)體低度炎癥［5］。但腸上皮局部的糖皮質(zhì)激素過(guò)多對(duì)腸道功能的影響目前并不清楚。因此，本文主要研究腸上皮特異性11β?HSD1 敲除小鼠的腸道上皮屏障功能變化，為腸道功能研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

與南京大學(xué)模式動(dòng)物研究院合作，本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及管理委員會(huì)審核通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：GP?TAP002），通過(guò)條件性敲除的F1代雜合子與腸道特異性的Lgr5?cre 小鼠進(jìn)行配對(duì)繁殖，將獲得的Loxp片段11β?HSD1基因敲除鼠以及腸道特異性的Lgr5?cre 工具鼠配對(duì)繁殖，獲得腸道上皮特異性的11β?HSD1基因敲除的純合子（11β?HSD1-/-）小鼠。

將C57BL/6 小鼠（6 周，雄性）（南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所）分為2 組，每組各8 只，一組給予普通飼料（D12450，10%kcal 脂肪，70%kcal 碳水化合物，20%kcal蛋白質(zhì)，Research Diets公司，美國(guó)），一組給予高脂飼料（D12492，60%kcal脂肪，20%kcal碳水化合物，20%kcal蛋白質(zhì)，Research Diets公司，美國(guó)），喂養(yǎng)8 周。C57BL/6 背景高脂飲食喂養(yǎng)的11β?HSD1（-/-）小鼠（6 周，雄性）（南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所），8只，喂養(yǎng)8周，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片及HE染色

小鼠喂養(yǎng)8 周后頸椎脫臼法處死，各組分別完整取出腸道做成圈狀，按照常規(guī)方法進(jìn)行固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘片等步驟制備石蠟切片，4℃冰箱保存。取石蠟切片，二甲苯中脫蠟5 min，新鮮二甲苯再次脫蠟5 min，無(wú)水乙醇5 min，90%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min，蘇木素染液5 min，浸自來(lái)水中洗去多余的染色液，約10 min，伊紅染液2 min。70%乙醇洗滌2 次后脫水，用中性樹(shù)膠封片。每組于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)HE染色的區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.2.2 過(guò)碘酸希夫（periodic acid?Schiff，PAS）糖原染色

取小鼠小腸組織石蠟切片，常規(guī)脫水包埋。取出過(guò)碘酸溶液，每個(gè)樣品滴加過(guò)碘酸溶液，在濕盒中避光反應(yīng)10 min 后，去除過(guò)碘酸溶液，置于搖床洗滌5 min。滴加Schiff 試劑，放入濕盒中，置于37 ℃烘箱避光染色1 h，去除染色液，置于搖床洗滌5 min。每個(gè)樣品滴加蘇木素染色液，染色30 s，去除染色液，蒸餾水漂洗2次以上，每次3 s，直到浮色洗去。待適當(dāng)干燥后中性樹(shù)膠封固。每組于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)PAS染色的組織隱窩區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.2.3 免疫組化

石蠟切片脫水，在組化圈內(nèi)滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。去除封閉液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗（F4/80，GB11027，1∶2 000；ZO?1，GB11195，1∶300，武漢Servicebio公司），切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標(biāo)記山羊抗兔，GB23303，1∶200，武漢Servicebio 公司）覆蓋組織，室溫孵育50 min。再次洗滌后滴加新鮮配置的DAB 顯色液。蘇木素復(fù)染3 min 左右，自來(lái)水洗后用1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。最后將切片脫水后稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 定量方法

HE 染色選取多個(gè)視野拍照后測(cè)量絨毛、隱窩長(zhǎng)度。PAS染色在光學(xué)顯微鏡下選取多個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞。免疫組化分析使用陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法，在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)多個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食喂養(yǎng)后小鼠體重變化

為了明確高脂飲食對(duì)小鼠的影響，對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，發(fā)現(xiàn)與正常飲食野生型小鼠（WT/NC）比較，高脂飲食野生型小鼠（WT/HFD）體重明顯增加，腸上皮11β?HSD1特異性敲除小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后體重也明顯增加（圖1）。

圖1 小鼠體重Figure 1 Weight of mice

2.2 高脂飲食導(dǎo)致小鼠小腸上皮絨毛、隱窩、杯狀細(xì)胞數(shù)量變化

為了明確高脂飲食對(duì)小腸形態(tài)的影響，利用小腸上皮組織HE 染色和小腸杯狀細(xì)胞PAS 染色，發(fā)現(xiàn)與正常飲食組小鼠比較，高脂飲食小鼠小腸絨毛長(zhǎng)度明顯增加，隱窩深度無(wú)明顯變化，杯狀細(xì)胞數(shù)量較正常飲食組有增多趨勢(shì)（圖2）。上述結(jié)果提示高脂飲食可導(dǎo)致小腸上皮吸收功能增加。

圖2 小鼠小腸上皮組織HE&PAS染色及定量Figure 2 HE&PAS staining and quantitative analysis of intestinal epithelium in mice

2.3 高脂飲食導(dǎo)致小鼠小腸上皮ZO?1 與F4/80 表達(dá)變化

為了進(jìn)一步研究高脂飲食對(duì)小腸上皮屏障功能和炎癥的作用，對(duì)緊密連接蛋白ZO?1和炎癥標(biāo)志物F4/80 進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常飲食組小鼠比較，高脂飲食小鼠小腸上皮ZO?1表達(dá)明顯增加（圖3）；炎癥標(biāo)志物F4/80表達(dá)也增加（圖3），說(shuō)明高脂飲食可導(dǎo)致小腸上皮炎癥增加，而緊密連接蛋白可能代償性增加。

圖3 小鼠小腸上皮組織ZO?1&F4/80染色及定量Figure 3 ZO?1&F4/80 immunohistochemistry staining and quantitative analysis of intestinal epithelium in mice

2.4 腸上皮11β?HSD1特異性敲除對(duì)小鼠小腸上皮絨毛、隱窩、杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

為了明確小鼠小腸上皮局部的糖皮質(zhì)激素活性對(duì)小腸上皮屏障功能的影響，構(gòu)建了腸上皮11β?HSD1 特異性敲除小鼠（11β?HSD1-/-）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予高脂飲食后，雖然腸上皮11β?HSD1 特異性敲除小鼠體重依然顯著增加，但小腸絨毛長(zhǎng)度明顯變短，隱窩變淺，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加（圖4），提示敲除11β?HSD1逆轉(zhuǎn)了高脂飲食導(dǎo)致的腸上皮形態(tài)變化。

圖4 腸上皮11β?HSD1特異性敲除小鼠小腸上皮組織HE&PAS染色及定量Figure 4 HE&PAS staining and quantitative analysis of intestinal epithelium in 11β?HSD1 specific knockout mice

2.5 腸上皮11β?HSD1特異性敲除對(duì)小鼠小腸上皮ZO?1與F4/80表達(dá)的影響

通過(guò)對(duì)腸上皮11β?HSD1特異性敲除小鼠緊密連接蛋白ZO?1、炎癥標(biāo)志物F4/80的免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高脂飲食野生型對(duì)照組小鼠比較，高脂飲食11β?HSD1 敲除組小鼠小腸ZO?1 表達(dá)降低，F(xiàn)4/80 表達(dá)也明顯減少（圖5），提示11β?HSD1 敲除可以減輕高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥。

圖5 11β?HSD1特異性敲除小鼠小腸ZO?1&F4/80免疫組化染色Figure 5 ZO?1&F4/80 immunohistochemistry staining and quantitative analysis of intestinal epithelium in 11β?HSD1 spe?cific knockout mice

3 討論

腸道不僅是人體最重要的營(yíng)養(yǎng)吸收器官，而且發(fā)揮物理和化學(xué)屏障作用，以維持組織穩(wěn)態(tài)［6］。與正常飲食比較，高脂飲食狀態(tài)下的腸道屏障系統(tǒng)發(fā)生明顯改變［7］。此外，高脂飲食后杯狀細(xì)胞中的脂肪酸誘導(dǎo)的未折疊蛋白會(huì)抑制黏液的分泌［8］。同時(shí)，高脂飲食會(huì)改變腸道菌群的分布，增加致病菌的數(shù)量［9］。小腸通透性增加，飲食及細(xì)菌代謝產(chǎn)物可從腸腔轉(zhuǎn)移至循環(huán)及外周組織，進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥、胰島素抵抗等。對(duì)于肥胖人群的研究也證實(shí)，其抗菌肽和黏液分泌減少、緊密連接蛋白表達(dá)下降，腸道屏障功能被明顯破壞［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致小鼠小腸絨毛長(zhǎng)度、杯狀細(xì)胞數(shù)量、緊密連接蛋白ZO?1、炎癥標(biāo)志物F4/80明顯增加，提示高脂飲食可導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞吸收功能增強(qiáng)、炎癥增加。

既往研究表明，抑制11β?HSD1 可減輕高脂飲食導(dǎo)致的脂肪組織的炎癥［11］，這為11β?HSD1 調(diào)控腸道組織的炎癥提供了基礎(chǔ)。有研究表明，糖皮質(zhì)激素可引起腸道屏障功能破壞，而用黏液補(bǔ)充劑可增強(qiáng)屏障功能從而防止糖皮質(zhì)激素所引起的腸道滲漏［12］。糖皮質(zhì)激素還可以通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體依賴(lài)的方式誘導(dǎo)跨上皮電阻的時(shí)間和劑量依賴(lài)性增加，細(xì)胞旁陽(yáng)離子通量減少，從而使得成孔緊密連接表達(dá)減少［13］。本課題組之前的研究表明，作為內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用的放大器，全面抑制11β?HSD1可改變腸道黏膜形態(tài)，增強(qiáng)腸道屏障功能［14］。但腸道組織中11β?HSD1的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管給予高脂飲食喂養(yǎng)，但腸道特異性11β?HSD1基因敲除小鼠的小腸絨毛變短、隱窩變淺，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，緊密連接蛋白ZO?1、炎癥標(biāo)志物F4/80明顯減少，與野生型小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)后的表型相反，提示11β?HSD1敲除后可逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的腸道屏障功能變化。高脂飲食導(dǎo)致的小鼠小腸上皮屏障功能變化與11β?HSD1的作用密切相關(guān)。而腸道特異性11β?HSD1是否會(huì)影響腸上皮細(xì)胞分化及增殖以及是否會(huì)對(duì)腸道微生物產(chǎn)生有利影響，尚需進(jìn)一步研究。