陸晨妍，龔穎蕓，付真真，顧經(jīng)宇，周紅文

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein conver?tase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）對(duì)肝臟攝取低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）及血清中各類富含膽固醇、甘油三酯及其他重要脂質(zhì)（如鞘脂）的脂蛋白顆粒具有重要的調(diào)節(jié)作用［1-6］。PCSK9 抑制劑已獲批上市作為降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的新型藥物［7-9］，PCSK9相關(guān)的病理生理調(diào)控研究方興未艾。既往本課題組及其他團(tuán)隊(duì)在胰島素抵抗、糖耐量受損及糖尿病人群中觀察到血清PCSK9 與胰島素水平或胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)存在一定的正相關(guān)關(guān)系［10-15］，提示機(jī)體胰島素含量以及對(duì)應(yīng)的血糖控制水平可能影響PCSK9含量，但截至目前，胰島素和血糖對(duì)于PCSK9的作用尚無定論［16-21］。有研究表明，饑餓24 h后小鼠肝臟中PCSK9的表達(dá)顯著下降［17-18］，而再次喂食后得到上調(diào)，同時(shí)小鼠6 h高胰島素［10 mU/（kg·min）］正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)肝臟PCSK9 的基因表達(dá)明顯上調(diào)［17］，但也有體外研究發(fā)現(xiàn)100 nmol/L 胰島素處理HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞系24 h 抑制了PCSK9 的合成［19］。有意思的是，在24 h人高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)前后血清PCSK9水平無明顯變化［20］，甚至另兩項(xiàng)針對(duì)肥胖人群進(jìn)行2～3 h 短時(shí)程鉗夾后PCSK9 含量下降［19，21］。以上證據(jù)提示體內(nèi)與體外、肥胖與正常體重、急性與慢性誘導(dǎo)的高胰島素狀態(tài)對(duì)血清PCSK9 水平的影響不完全一致。

已知PCSK9 在循環(huán)中的半衰期約為5 min［22］，且其與血漿蛋白的結(jié)合存在動(dòng)態(tài)變化。既往研究主要集中探究各因素對(duì)肝臟合成PCSK9 的直接影響［5］，以及長(zhǎng)期高胰島素狀態(tài)下PCSK9含量情況，而缺乏血糖或者胰島素短期波動(dòng)對(duì)PCSK9清除、再分布等環(huán)節(jié)的研究。本研究利用靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)（intravenous glucose tolerance test，IVGTT）過程中靜脈葡萄糖負(fù)荷引發(fā)的血糖及胰島素急遽波動(dòng)，檢測(cè)過程中PCSK9水平的變化，探究現(xiàn)象背后的潛在生物學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

本研究納入2014 年6 月—2015 年12 月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科招募肥胖或糖代謝異常患者52例，同期招募既往無糖代謝異常個(gè)人史及糖尿病家族史的志愿者23例，首先進(jìn)行口服葡萄糖耐量對(duì)糖代謝狀態(tài)分型，間隔1周使用IVGTT評(píng)估胰島素一相分泌能力。因重要臨床數(shù)據(jù)不全、留取血清樣本溶血影響胰島素檢測(cè)排除5例，最終納入70例進(jìn)行后續(xù)研究。本研究項(xiàng)目獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2014?SR?003），所有受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料及指標(biāo)測(cè)定

所有參與者均經(jīng)詳細(xì)病史詢問，測(cè)量并記錄身高、體重、腰圍等指標(biāo)，計(jì)算體重指數(shù)（body mass in?dex，BMI）。隔夜空腹10 h 以上采集靜脈血測(cè)定血清代謝指標(biāo)包括總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）、LDL?C、甘油三酯（TG）、脂蛋白（a）［Lp（a）］、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、L?γ?谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、總蛋白、白蛋白、血糖、肌酐等指標(biāo)，上述指標(biāo)使用對(duì)應(yīng)的羅氏試劑盒在COMBAS 平臺(tái)檢測(cè)。

1.2.2 75 g 口服葡萄糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）評(píng)估

過夜空腹10 h，采集空腹靜脈血，口服75g葡萄糖后，健康志愿者僅留取120 min血樣，其他受試者留取0、30、60、120 min采集靜脈血，測(cè)定血糖水平。

1.2.3 IVGTT 評(píng)估一相胰島素分泌能力，作為葡萄糖刺激胰島素分泌導(dǎo)致急性高血糖高胰島素波動(dòng)模型

口服葡萄糖耐量結(jié)束至少1 周后進(jìn)行IVGTT。受試者過夜空腹后留取空腹血，預(yù)設(shè)輸液泵在3 min內(nèi)按照0.3 g/kg 的劑量靜脈輸注20%的葡萄糖溶液，結(jié)束時(shí)歸零計(jì)時(shí)器。隨后分別在1、2、4、6、8、10、60 min 取血測(cè)定血糖，同期留取2、4、6、8、10、60 min的血清連同空腹血清樣本測(cè)定胰島素與C肽含量。另分別分裝0、4、10、60 min的血清樣本50 μL用于后續(xù)血清PCSK9水平的測(cè)定。所有待測(cè)樣本在冰上短暫儲(chǔ)存后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清PCSK9水平

使用武漢博士德公司生產(chǎn)的商品化人PCSK9 ELISA 法測(cè)定試劑盒（EK1147）測(cè)定，將待檢測(cè)的血清樣本平衡至室溫后混勻，取5 μL進(jìn)行稀釋后按照說明書操作，檢測(cè)設(shè)立復(fù)孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣本中實(shí)際PCSK9含量，具體操作同前述報(bào)道［23］。

1.2.5 高通量靶向脂質(zhì)組學(xué)方法

IVGTT空腹血清樣本依托常州中科脂典生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)定血清脂質(zhì)組學(xué)。使用氯仿∶甲醇（1∶1）從血清樣本中提取脂質(zhì)，基于前述的Exion超高效液相色譜系統(tǒng)與QTRAP 6500 PLUS 系統(tǒng)（Sciex）串聯(lián)檢測(cè)平臺(tái)開展定量檢測(cè)［24］。

1.2.6 公式計(jì)算

HOMA?IR使用如下公式計(jì)算：空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（pmol/L）/22.5。取靜脈葡萄糖注射后2 min 與4 min 血清胰島素平均值與0 min 胰島素水平的差值評(píng)估的一相胰島素分泌能力（first?phase insulin release，F(xiàn)PIR）。結(jié)合胰島素和循環(huán)中PCSK9的半衰期4～5 min，定義P4/0為4 min PCSK9與0 min PCSK9的比值來區(qū)分PCSK9的變化趨勢(shì)，P4/0＜0.8為下降組，0.8≤P4/0≤1.2 為穩(wěn)定組，P4/0＞1.2 為上升組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性分布的檢驗(yàn)和方差齊性的檢驗(yàn)。對(duì)符合正態(tài)分布的連續(xù)變量，使用Pearson法進(jìn)行兩因素之間的相關(guān)性分析，對(duì)不符合正態(tài)性分布的連續(xù)變量以及等級(jí)變量，使用Spearman法進(jìn)行分析。對(duì)于正態(tài)分布的連續(xù)變量，使用one?way ANOVA進(jìn)行組間差異性比較，并進(jìn)行兩兩比較的事后檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 總體基線PCSK9 水平與多個(gè)代謝指標(biāo)呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性

總體基線PCSK9水平與年齡、TC、LDL?C、AST、GGT、C 肽水平存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系（表1）；且其與TC、C肽的正相關(guān)性在校正上述其他相關(guān)性因素后仍然存在（表2）；但其與空腹胰島素水平無顯著相關(guān)性。

2.2 血清PCSK9水平動(dòng)態(tài)變化

利用IVGTT 下建立的高血糖、高胰島素模型，結(jié)合循環(huán)中胰島素及PCSK9半衰期4～5 min的特點(diǎn)，選用0、4、10 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血清PCSK9水平的動(dòng)態(tài)變化。比較4 min與0 min PCSK9的比值（P4/0）（圖1A），發(fā)現(xiàn)在IVGTT 的0～10 min 內(nèi)PCSK9 的變化呈下降、上升、基本不變3 種趨勢(shì)，進(jìn)一步根據(jù)趨勢(shì)分布及近似三分法的策略，界定P4/0＜0.8為下降組（n=22 例），0.8≤P4/0≤1.2 為穩(wěn)定組（n=15 例），P4/0＞1.2 為上升組（n=33 例），后續(xù)分析依據(jù)上述分組展開。下降組基線PCSK9 水平較穩(wěn)定組和上升組均有明顯升高［（111.56±50.38）ng/mLvs.（65.67±30.19）ng/mL，P＜0.001；（111.56±50.38）ng/mLvs.（68.38±23.83）ng/mL，P＜0.001，圖1B］，而3 組在年齡、性別、BMI、空腹血糖等指標(biāo)間無顯著差異（表3）。盡管下降組的空腹胰島素水平較其他兩組稍高［（207.9±118.2）μmol/Lvs.（124.8±97.0）μmol/L，（122.9±122.7）pmol/L］，P=0.023），但3 組間一相胰島素分泌（FPIR）不存在顯著差異（P=0.703）。有意思的是，IVGTT 第4 min（血糖、胰島素水平達(dá)峰狀態(tài)）及IVGTT 第10 min（胰島素一相分泌結(jié)束），3組PCSK9水平均無顯著差異（圖1C、D），即在IVGTT過程中3 組PCSK9 從不同的起始狀態(tài)趨向同一水平。還觀察到IVGTT后60 min下降組PCSK9水平較其他兩組有顯著升高［（109.19±36.69）ng/mLvs.（78.71±38.52）ng/mL，P＜0.01；（109.19±36.69）ng/mLvs.（77.54.38±30.30）ng/mL，P＜0.001］，與基線PCSK9 水平相近。此外，下降組HOMA?IR較穩(wěn)定組及上升組顯著升高（表3）；且根據(jù)OGTT 結(jié)果，下降組中糖尿病前期、糖尿病人數(shù)占比顯著高于穩(wěn)定組及上升組（圖2）。

表1 基礎(chǔ)血清PCSK9水平與各代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between basal serum PCSK9 levels and various metabolic markers

表2 基礎(chǔ)血清PCSK9水平與各相關(guān)代謝指標(biāo)的線性回歸分析Table 2 Linear regression analysis of basal serum PCSK9 levels and related metabolic markers

圖1 靜脈葡萄糖耐量（IVGTT）下血清PCSK9水平的變化模式Figure 1 Changes of serum PCSK9 levels during intravenous glucose tolerance（IVGTT）

2.3 不同PCSK9 波動(dòng)模式對(duì)循環(huán)中鞘脂代謝的影響與聯(lián)合分析

39例基線血清脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)顯示（其中下降組9 例（23%），穩(wěn)定組9 例（23%），上升組21 例（54%）），3組間神經(jīng)酰胺（Cer）、葡糖神經(jīng)酰胺（Glu?Cer）有顯著差異（表4），且基線PCSK9水平與Cer存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.442，P=0.005）。下降組Cer、Glu?Cer顯著高于其他兩組（圖3）。亞類分析方面，游離脂肪酸（FFA）12：0、Cer d18：1/22：0、Cer d18：1/24：1、Cer d18：1/24：0、GluCer d18：1/16：0、GluCer d18：1/18：0、GluCer d18：1/20：0、GluCer d18：1/22：0、Glu?Cer d18：1/24：1、GluCer d18：0/24：1、GluCer d18：1/24：0、GluCer d18：0/24：0、乳糖神經(jīng)酰胺（LacCer）d18：1/20：0、LacCer d18：1/22：0、神經(jīng)節(jié)苷脂（GM3）d18：0/24：0 在3 組間存在顯著差異。雙變量相關(guān)性分析顯示，基線PCSK9水平與Cer、GM3、FFA 12：0、Cer d18：1/24：0、GM3 d18：0/24：0 存在正相關(guān)關(guān)系，且進(jìn)一步校正了BMI、血脂等其他已知相關(guān)因素后，基線PCSK9 與Cer d18：1/24：0 及GM3 d18：0/24：0的正相關(guān)關(guān)系仍然存在。

3 討論

本研究主要有以下發(fā)現(xiàn)：①在靜脈葡萄糖負(fù)荷10 min 內(nèi)血糖升高引發(fā)的胰島素急遽升高過程中，血清PCSK9水平的變化呈現(xiàn)下降、穩(wěn)定、上升3種趨勢(shì)，且負(fù)荷后PCSK9下降組基線PCSK9水平顯著高于其他兩組。②下降組LDL?c、空腹胰島素、空腹C肽、HOMA?IR、AST和GGT顯著高于其他兩組，且胰島素抵抗程度更重、糖代謝異常人數(shù)占比更高。③進(jìn)一步使用高通量靶向脂質(zhì)組學(xué)分析各組基線游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺及其下游代謝產(chǎn)物的含量發(fā)現(xiàn)，下降組的血清總神經(jīng)酰胺、總葡糖神經(jīng)酰胺水平也顯著高于其他兩組，且基線PCSK9 與Cer d18：1/24：0 及GM3 d18：0/24：0 的正相關(guān)關(guān)系經(jīng)校正后仍然存在。

既往研究在健康青年人群、肥胖絕經(jīng)后女性人群、2 型糖尿病人群中采用2～24 h 時(shí)長(zhǎng)不等的高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)構(gòu)建了不同血清胰島素終濃度的高胰島素狀態(tài)，比較干預(yù)前后循環(huán)中PCSK9水平的差異，結(jié)果不相一致［16-21］。結(jié)合循環(huán)中胰島素及PCSK9 蛋白半衰期4～5 min 的特點(diǎn)，本研究旨在觀察IVGTT 過程中急遽升高的血糖和胰島素情況下，觀察不同性別、BMI、糖代謝人群中PCSK9 對(duì)急性刺激的響應(yīng)，此前未見相關(guān)報(bào)道。且本研究在包含正常代謝及糖代謝異常疾病的綜合人群中觀察到急劇血糖升高引發(fā)的胰島素水平波動(dòng)對(duì)血清PCSK9水平的影響存在異質(zhì)性，呈現(xiàn)下降、穩(wěn)定、上升3 種變化趨勢(shì)，不僅再次證實(shí)血糖及胰島素是血清PCSK9水平的影響因素，而且為先前人群和動(dòng)物研究結(jié)論不一致提供了依據(jù)。后續(xù)分組分析顯示，下降組基線PCSK9高于其他兩組，且胰島素抵抗相關(guān)代謝指標(biāo)也高于其他兩組，這與本課題組及其他團(tuán)隊(duì)先前報(bào)道的基線PCSK9水平與空腹胰島素、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相平行的結(jié)論基本吻合，進(jìn)一步提示機(jī)體本身的糖代謝狀態(tài)與PCSK9 含量及代謝密切相關(guān)。更重要的是，本研究觀察到盡管穩(wěn)定組與上升組代謝指標(biāo)無明顯差異，但PCSK9在血糖及胰島素急遽波動(dòng)下的變化模式存在差異，還需要進(jìn)一步隨訪研究及前瞻性研究評(píng)估PCSK9 波動(dòng)模式對(duì)遠(yuǎn)期糖代謝表型的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究還發(fā)現(xiàn)，IVGTT引發(fā)的血清PCSK9 變化不能長(zhǎng)久維持，到1 h 基本消退，因此胰島素對(duì)血清PCSK9的結(jié)合、釋放、清除等過程的具體影響及作用機(jī)制還有待深入探討。

表3 按IVGTT過程中血清PCSK9在4 min與0 min的比值分組基線資料Table 3 Baseline data of groups according to the ratio of serum PCSK9 at 4 min to 0 min during IVGTT

圖2 PCSK9不同變化模式中糖代謝情況分布。Figure 2 Distribution of glucose metabolism of different PCSK9 patterns

表4 PCSK9波動(dòng)模式與基線血清脂質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析Table 4 Combined analysis of PCSK9 fluctuation patterns and baseline serum lipidomics（nmol/L）

圖3 各組基線總神經(jīng)酰胺、總葡糖神經(jīng)酰胺水平及其與基線PCSK9水平的相關(guān)性Figure 3 Basal total ceramide and total glucoseramide levels，and their correlation with basal PCSK9 levels

通過脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了基線PCSK9 水平與Cer d18：1/24：0及GM3 d18：0/24：0存在較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，提示神經(jīng)酰胺和葡糖神經(jīng)酰胺可能在PCSK9生理代謝過程中具有重要作用。目前公認(rèn)的是PC?SK9 對(duì)以LDL 為首的脂蛋白顆粒整體代謝的影響，但PCSK9 與脂質(zhì)亞類之間的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究，脂類的代謝波動(dòng)對(duì)PCSK9在循環(huán)中的分布及代謝是否存在影響還有待收集更多充分有力的證據(jù)。

今后將進(jìn)一步加大納入例數(shù)，從而進(jìn)一步提高研究結(jié)果的充分性和可靠性。另外本研究?jī)H檢測(cè)了基線血清脂質(zhì)組學(xué)，動(dòng)態(tài)分析IVGTT 過程中PC?SK9 水平變化與脂質(zhì)組學(xué)的變化可能更具研究?jī)r(jià)值，相關(guān)工作正在開展。

綜上所述，基于循環(huán)PCSK9 半衰期約5 min 的特點(diǎn)，探索了短期血糖及胰島素急遽波動(dòng)對(duì)循環(huán)PCSK9 水平的影響。靜脈葡萄糖輸注引發(fā)的胰島素急遽升高對(duì)PCSK9水平的影響存在個(gè)體異質(zhì)性，與代謝狀態(tài)密切相關(guān)，具體作用環(huán)節(jié)、作用靶點(diǎn)、作用方式還有待基礎(chǔ)研究進(jìn)一步闡明。