王藝睿，王 皓，劉碩琛，倪 鳴，李相成

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽中心，江蘇 南京 210029

慢性肝炎是肝硬化的主要病因，全球每年有100多萬人死于肝硬化，目前中國有多達700萬人患有肝硬化，而且患病人數(shù)不斷增加［1］。肝硬化晚期患者通常由于肝功能受損、胃食管靜脈曲張、腹水甚至肝細胞癌而導致預后不良［2］。

巨噬細胞在很多人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，運用巨噬細胞的治療方案已經(jīng)用于許多不同的疾病當中，如腎病、遺傳性肺泡蛋白沉積癥和肝纖維化［3］。雖然巨噬細胞在肝臟纖維化中起重要作用已經(jīng)被公認，但是巨噬細胞在肝臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展中的作用機制尚不清楚［4］。

NOD 樣受體家族3（nucleotide?binding oligomer?ization domain?like receptors，NLRP3）炎癥小體信號通路可由多種炎癥因子激活［5］，其中氧化應激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是NLRP3激活的關(guān)鍵因素。應激誘導的ROS通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路進而誘導NLRP3 激活來介導宿主防御反應［6］。NIMA 相關(guān)蛋白激酶7（never in mitosis gene a?relat?ed kinase 7，NEK7）則是通過NEK7?NLRP3 的相互作用從而啟動NLRP3 激活的關(guān)鍵介質(zhì)，以響應ROS［7］。NEK7 和NLRP3 之間相互結(jié)合促進炎癥小體的組裝以及NLRP3炎癥小體的形成，進而導致含半胱氨酸的天門冬氨酸蛋白水解酶?1（cysteinyl as?partate specific proteinase?1，caspase?1）的激活，白細胞介素（interleukin，IL）?1β的分泌和成熟［8］。因此，NEK7?NLRP3復合體可能在炎癥反應過程中起到炎癥小體感受器的作用。本研究即探討NEK7在肝臟炎癥及纖維化形成中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；Veriti PCR儀（Applied Biosystems 公司，美國）；WIX mini 電泳儀和酶標儀（北京Wix Technology 公司）；Pannoram?ic DESK掃描儀（3D HISTECH公司，匈牙利）；TRIzol（Invitrogen 公司，美國）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green PCR（南京諾唯贊生物科技有限公司）；免疫組化試劑盒、Masson、天狼星紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清、DMEM 細胞培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；NEK7抗體（Abcam公司，美國）；ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；NLRP3、IL?1β、C?caspase?1和β?actin 等抗體（CST 公司，美國）；LY6G、CD11b 和F4/80 等抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）；NS?siRNA、NEK7?siRNA、siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（sc?61175，Santa Cruz Biotechnol?ogy公司，美國）。

所有肝臟標本取自南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝切除患者。根據(jù)Metavir 評分和病理組織報告對患者肝組織的樣本進行分析。正常對照男3例，女2例，年齡（48.3±4.2）歲，肝硬化評分為0～1分；纖維化患者中，男4例，女1例，年齡（58.6±3.5）歲，肝硬化評分為3～4分。本研究得到南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準（倫理批號：2018?SRFA?197）。

SPF 級8 周齡的C57BL/6J 雄性小鼠20 只，均采購自南京醫(yī)科大學動物中心。分籠試養(yǎng)，在室溫下每天予以12 h光照，自由飲水、攝食。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組和模型制備

C57BL/6J 小鼠采用腹腔注射四氯化碳（CCL4，10%橄欖油，2 mL/kg，每周2次，共8周）建立小鼠肝臟纖維化模型組；對照組則采用C57BL/6J小鼠腹腔注射10%橄欖油。巨噬細胞特異性表達甘露糖受體，運用甘露糖偶聯(lián)聚合物作為載體，將NS?siRNA 和NEK7?siRNA與甘露糖偶聯(lián)聚合體混合靜置20 min，在腹腔注射CCl4造模4 h之前，通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（siRNA 2 mg/kg，每周2 次，共8 周），用于特異性干擾小鼠巨噬細胞中NEK7 的表達。具體分組：橄欖油+NS?siRNA 組，橄欖油+NEK7?siRNA 組，CCL4+NS?siRNA組，CCL4+NEK7?siRNA組，每組5只。

1.2.2 組織免疫化學染色

所有標本均用10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，行免疫組化染色，梯度酒精脫水，丙酮固定，抗原修復，加入NEK7抗體過夜，第2天經(jīng)PBST 沖洗3 次，加入二抗，室溫孵育30 min，沖洗3次。

1.2.3 HE、Masson和天狼星紅染色

HE 染色：切片脫蠟處理后，使用蘇木素染色液染色10 min，蒸餾水洗滌，伊紅染色液染色2 min。進行乙醇脫水、二甲苯透明，封片劑封片。Masson染色：切片常規(guī)脫蠟，依次使用蘇木素染色液、Mas?son 藍化液和麗春紅品紅染色液染色后，弱酸工作液洗滌，行脫水、透明、封片劑封片。天狼星紅染色：切片脫蠟，天狼星紅染色液滴染1 h，蒸餾水沖洗后，行蘇木素染色液染核，行脫水、透明、封片劑封片。

1.2.4 組織免疫熒光染色

切片抗原抗體修復與脫蠟處理后，用固定液固定30 min。洗滌液洗滌，用封閉液封閉60 min，去除封閉液，用稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，去除一抗，用洗滌液洗滌。加入帶有熒光標記的二抗避光孵育60 min，洗滌液洗滌，DAPI 染色60 min，洗滌液洗滌，封片劑封片。

1.2.5 Western blot檢測

取少量肝臟組織塊并用剪刀盡量剪碎，加入500 μL 裂解液后置于冰上裂解30 min，4 ℃12 000g離心15 min離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣本行SDS?PAGE，采用電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上。采用快速封閉液封閉30 min 后，分別加入NEK7、IL?1β和C?caspase?1一抗4 ℃孵育過夜，次日加入二抗室溫孵育2 h，加入化學顯影液曝光。

1.2.6 qRT?PCR檢測

取小鼠肝組織研磨后加入TRIzol 試劑提取組織總RNA，測定濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在37 ℃15 min，85 ℃5 s 的條件下反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在避光條件下，將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA 溶液1 μL，與0.2 μL的前引物，0.2 μL 的后引物，5 μL的SYBR Green，以及3.6 μL 無RNA 酶的ddH2O 配制成10 μL 體系。采用2-ΔΔCt值計算mRNA 的相對表達量。每組試驗均重復至少3次。相關(guān)引物序列見表1。

表1 qRT?PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for qRT?PCR

1.2.7 提取純化肝臟巨噬細胞

用腹腔注射戊巴比妥的方法麻醉C57BL/6J 小鼠，開腹，暴露肝葉下方的門靜脈，將留置針插入其中，拔出針芯，灌注事先預熱準備的37 ℃灌注液，肝臟充盈一段時間后，剪斷下腔靜脈，灌注到流出液體為清亮液體，再用事先預熱準備的具有膠原酶的37 ℃灌注液，一直灌注至肝臟柔軟。取出肝臟，去除多余組織，放置消化液中靜置15 min，通過無菌濾嘴過濾，收集過濾后的組織液體，50g離心2 min，取上清液體500g離心8 min，然后用培養(yǎng)基重懸沉淀，分別采用3 mL 的50%Percoll 液、25%Percoll 液和3 mL的細胞懸浮液鋪層，800g離心15 min，吸取中間一層至離心管中，500g離心8 min，培養(yǎng)基重懸沉淀，鋪板，30 min 后換液，留下貼壁細胞，用于West?ern blot檢測NEK7?siRNA的干擾效率。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學分析及相關(guān)繪圖通過GraphPad Prism 6軟件實現(xiàn)。所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK7在肝纖維化患者肝臟組織中的表達

為了檢測NEK7在正常肝臟及肝纖維化患者肝臟組織中的表達，分別取5 例正常肝臟組織和5 例肝纖維化患者肝臟組織包埋切片，通過HE 和Mas?son 染色觀察發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者較正常肝臟組織肝纖維化更為明顯（圖1A）。通過qRT?PCR 技術(shù)檢測對比發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者纖維化相關(guān)指標金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloprotein?ases 1，TIMP1）和Ⅰ型膠原蛋白（Collagen?Ⅰ）的RNA 水平明顯升高（圖1B）。同時采用qRT?PCR 技術(shù)及Western blot 技術(shù)檢測表明，NEK7 mRNA 和蛋白的表達水平在纖維化肝臟組織明顯高于正常肝臟組織（圖1C）。此外，通過免疫組織熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)CD68陽性細胞中NEK7的表達量顯著增加（圖1D）。這些結(jié)果表明在肝纖維化患者的肝臟組織中NEK7表達上調(diào)，尤其是在巨噬細胞當中。

圖1 NEK7在正常肝臟和肝纖維化患者肝臟組織中的表達Figure 1 Expression of NEK7 in liver tissues of normal and liver fibrosis

2.2 干擾小鼠巨噬細胞中NEK7的表達對肝臟纖維化的影響

通過HE、Masson 和天狼星紅組織化學染色技術(shù)，觀察到未經(jīng)過腹腔注射CCL4的小鼠肝臟無明顯纖維化，然而采用CCL4腹腔注射的小鼠當中，NS?siRNA組較NEK7?siRNA組纖維化明顯（圖2A）。同時采用qRT?PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NS?siRNA 組較NEK7?siRNA 組纖維化指標Collagen、Collagen?Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白（Collagen?Ⅱ）、TIMP1、轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）的基因表達水平更高（圖2B）。

圖2 抑制小鼠巨噬細胞中NEK7的表達可減輕肝臟纖維化的程度Figure 2 NEK7 deficiency in macrophages alleviates CCl4?induced liver fibrosis

2.3 NEK7 可通過NLRP3 炎癥小體信號通路調(diào)控炎癥反應和纖維化

為了進一步探討NEK7減輕炎癥反應和肝臟纖維化發(fā)生和發(fā)展的機制，通過免疫組織化學染色和免疫熒光染色，檢測了LY6G、CD11b 和F4/80 的表達，發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細胞中NEK7 的表達可以減輕肝臟纖維化時中性粒細胞和巨噬細胞的聚集以及炎癥反應（圖3A、B、C）。通過ELISA 試劑Oil盒檢測各組小鼠血清中IL?1β水平的差異（圖3D）。為了驗證甘露糖偶聯(lián)聚合體體系中NEK7?siRNA對肝臟巨噬細胞的敲低效率，通過肝臟灌注純化獲取肝臟巨噬細胞，并進行了Western blot實驗加以驗證，結(jié)果顯示，NEK7?siRNA較NS?siRNA組巨噬細胞中的NEK7的表達明顯被抑制（圖3E）。同時我們測定了NLRP3、IL?1β和C?caspase?1 的蛋白表達，結(jié)果顯示，NEK7?siRNA 組中相應表達量明顯減少（圖3F），因此認為NEK7可通過NLRP3炎癥小體信號通路調(diào)控小鼠肝臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展進程。

圖3 NEK7可通過NLRP3炎癥小體信號通路調(diào)控炎癥反應和纖維化Figure 3 NEK7 can regulate inflammation response and liver fibrosis by NLRP3 signaling pathway

3 討論

肝臟纖維化是慢性肝臟疾病的常見病理結(jié)果［9］。慢性肝炎的患者常可觀察到過度肝臟纖維化。肝臟纖維化的發(fā)展是慢性肝病的主要并發(fā)癥之一，其臨床結(jié)局很多，如與肝纖維化相關(guān)的腹水和食管靜脈曲張的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。有研究表明，在有纖維化病變的小鼠肝臟組織中NEK7的表達增加，然而，目前巨噬細胞中NEK7 對纖維化的影響未見報道。此前，本團隊［10-11］以及Yue 等［12］都采用甘露糖偶聯(lián)聚合體體系聯(lián)合siRNA 進行小鼠尾靜脈注射，用于體內(nèi)特異性干擾巨噬細胞內(nèi)基因表達。其中Yue等［12］研究證實了巨噬細胞中的熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor，HSF1）通過NLRP3 炎癥小體信號通路調(diào)節(jié)小鼠肝臟缺血再灌注中的損傷，其對下游巨噬細胞中NLRP3的回復實驗中，運用甘露糖偶聯(lián)聚合體體系，在小鼠肝臟缺血再灌注造模4 h前，通過尾靜脈注射特異性干擾RNA抑制巨噬細胞中NLRP3 的表達。證實了在缺血再灌注損傷模型中，抑制巨噬細胞中HSF1 的表達可以促進炎癥反應從而加重損傷。本文探究的NEK7已經(jīng)被確定為NLRP3 炎癥小體激活的選擇性上游調(diào)節(jié)因子［13］，NEK7可以通過激活NLRP3進而促進炎癥反應。

慢性肝損傷不僅由損傷劑對肝細胞的直接作用引起，還與伴隨的先天免疫反應產(chǎn)生的細胞因子有關(guān)。肝臟炎癥和纖維化是由復雜的免疫途徑控制，因而涉及許多可能的治療靶點。對炎癥潛在機制的理解應該轉(zhuǎn)化為臨床治療的方法［14］。最近的研究表明，巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，參加肝臟炎癥反應。巨噬細胞的主要功能涉及細胞因子的產(chǎn)生，并共同構(gòu)成一個高度復雜的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡。雖然肝臟巨噬細胞在肝臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，但其潛在的機制在很大程度上仍然是未知的。

由NOD樣受體形成的炎癥小體中，NLRP3是最具有特征性的NOD 樣受體。NLRP3 炎癥小體是一個重要的信號轉(zhuǎn)導節(jié)點，控制著IL?1β和IL?18 這2個因子的成熟［15］。NLRP3炎癥小體組裝完成后，將休眠的pro?caspase?1 裂解成活化的caspase?1。隨后，caspase?1將細胞因子前體pro?IL?1β和pro?IL?18轉(zhuǎn)化為成熟的、具有生物活性的IL?1β和IL?18。NEK7 作為在脊髓動物中發(fā)現(xiàn)的11 種NEK 激酶之一，屬于調(diào)節(jié)有絲分裂進程中和DNA 損傷反應的NIMA 相關(guān)激酶（NRKs）家族，已經(jīng)被確定為NLRP3炎癥小體激活的選擇性上游調(diào)節(jié)因子［13］。相應的，caspase?1 的激活和IL?1β的釋放在沒有NEK7 激活NLRP3炎癥小體的信號轉(zhuǎn)導下將被取消。因此，這說明了NLRP3?NEK7 相互作用在NLRP3 炎癥小體激活中的特異性和重要性。本研究表明，NEK7 缺乏可以通過減少巨噬細胞中細胞因子的產(chǎn)生來減輕CCL4導致的肝臟炎癥。

綜上所述，本研究表明，肝纖維化患者較正常人肝臟組織中NEK7 的表達上調(diào)，體內(nèi)特異性抑制巨噬細胞中NEK7的表達可以通過NLRP3炎癥小體信號通路來減輕肝臟炎癥反應和緩解肝臟纖維化。本研究結(jié)果提示，NEK7 可能在肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵性作用，可以作為臨床上治療肝硬化潛在的候選藥物靶點。