湯澤華，朱文卿，邱 憬

南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029

純鈦具有優(yōu)異的理化性能、良好的生物相容性及骨整合潛能，是口腔種植體最常用的材料之一。鈦表面的理化特性決定了能否快速建立牢固的骨結(jié)合，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對鈦種植體的表面處理進(jìn)行了諸多嘗試，以期提高成骨速度，增加骨結(jié)合強(qiáng)度［1-4］。已有文獻(xiàn)報道，純鈦表面和修飾改性鈦表面均存在時間依賴的生物活性老化現(xiàn)象［5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，純鈦表面的二氧化鈦表層會吸附空氣中的碳?xì)浠衔镄纬商祭鄯e，且碳累積量與鈦表面親水性呈顯著的負(fù)相關(guān)性［6］。老化鈦表面生物相容性的降低可能與表面親水性的減弱有關(guān)，新制備的鈦表面具有超親水性，隨著時間的延長逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，成骨?xì)胞黏附、擴(kuò)散、增殖和堿性磷酸酶活性均呈時間依賴性降低［7-8］。動物實驗表明，在早期愈合階段，存放4 周后植入的鈦種植體周圍骨覆蓋率不足新鮮表面的50%［9］。

為了延緩鈦種植體表面的生物活性老化，提高鈦表面的骨結(jié)合效率，鈦種植體存儲媒介的優(yōu)化已成為研究熱點。國內(nèi)外研究已提出了多種抗老化方法，如紫外光功能化、鹽溶液浸泡、等離子體處理、低真空存儲等［10-11］。其中，鹽溶液最為方便、經(jīng)濟(jì)。有文獻(xiàn)報道生理鹽水存儲可以減少鈦表面碳累積，改善鈦表面的親水性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、擴(kuò)散和增殖，提高Ⅰ型膠原表達(dá)和鈣沉積水平［12］。臨床中已經(jīng)運用生理鹽水進(jìn)行種植體存儲，如ITI?Slactive 親水性種植體。但在種植區(qū)骨量不足或骨質(zhì)條件差的情況下，開發(fā)具有更強(qiáng)骨誘導(dǎo)活性的種植體存儲液勢在必行。

近年來，蛋白包裹的近紅外硫化銀（Ag2S）量子點因其良好的生物相容性及在生物介質(zhì)中良好的分散性被廣泛應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域［13］。有學(xué)者以牛血清白蛋白（boviaue serum albumin，BSA）為穩(wěn)定劑，在水溶液中制備納米銀材料，可形成穩(wěn)定的分散體，在納摩爾范圍內(nèi)產(chǎn)生最佳抗菌活性，且遠(yuǎn)低于體外測定的成骨細(xì)胞毒性濃度，合成的納米銀顆?？勺鳛樯锊牧匣蛩幬锂a(chǎn)品的添加劑，分散在水溶液中，或涂覆于不同材料表面［14］。Zhou等［15］研究發(fā)現(xiàn)，包裹納米銀顆粒的絲纖蛋白基涂層具有良好的蛋白吸附性、親水性和持久的抗菌性能。體外研究表明，該涂層不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞附著、擴(kuò)散和增殖，還能增強(qiáng)堿性磷酸酶表達(dá)、膠原分泌和礦化。體內(nèi)研究顯示，具有骨架結(jié)構(gòu)的涂層顯著改善了新生骨的生成以及軟組織結(jié)合，有助于形成快速而持久的骨整合。由此推測蛋白包裹的Ag2S水溶液可用于鈦種植體的儲存，為開發(fā)新的種植體存儲液提供不同的思路。本研究制備一種BSA包裹的Ag2S 種植體存儲液，評估Ag2S@BSA 存儲液對鈦表面特性和成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

商用純鈦（99.5%，寶雞鈦業(yè)），砂紙（天津南景），氯化鈉、乙酸銀、硫化鈉、氫氧化鈉（分析純，上海國藥），BSA（南京生興生物），掃描電子顯微鏡（MAIA3 RISE，Tescan 公司，捷克），X 射線能譜儀（ULTIM EXTREME，Oxford公司，英國），標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)接觸角儀（SL200B，科諾公司，美國），小鼠MC3T3?E1細(xì)胞系（上海中科院細(xì)胞庫），α?MEM、FBS、青?鏈霉素雙抗、胰酶（Gibco公司，美國），鬼筆環(huán)肽（Cyto?skeleton 公司，美國），DAPI、CCK?8、RIPA 裂解液（上海碧云天），BCA試劑盒（南京凱基生物），堿性磷酸酶測試盒（南京建成），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），多功能酶標(biāo)儀（Spectramax 190，MD公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（CLSM710，Zeiss公司，德國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海天能5200）。

1.2 方法

1.2.1 存儲液及試件制備

存儲液的制備：Ag2S@BSA 存儲液的制備：定量稱取乙酸銀、硫化鈉和BSA，雙蒸水依次溶解配制為0.01 mol/L乙酸銀溶液、0.1 mol/L硫化鈉溶液和20 g/L BSA溶液。將乙酸銀溶液與BSA溶液以適量體積混合，所得混合液調(diào)節(jié)pH 至堿性后與硫化鈉溶液以適量體積混合得到Ag2S@BSA存儲液。生理鹽水存儲液制備：定量稱取氯化鈉粉末，雙蒸水稀釋為0.9%的氯化鈉溶液。BSA 存儲液制備：定量稱取BSA粉末，雙蒸水稀釋為5 g/L的BSA溶液。

試件制備：純鈦片經(jīng)砂紙打磨拋光，超聲清洗并干燥后備用。將純鈦試件隨機(jī)分為4 組，分別密閉保存于空氣（Air）、生理鹽水（Saline）、BSA 溶液、Ag2S@BSA 溶液中2 周后觀察鈦片表面特性及成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1.2.2 鈦表面特性分析

4組鈦片在不同介質(zhì)中保存2周后，晾干后使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察試件的表面微形貌，X 線能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS）分析4 種介質(zhì)中存儲2 周后的試件表面元素分布情況。隨機(jī)選取4種介質(zhì)中存儲2周后的試件各3 枚，接觸角儀測量鈦片的接觸角及表面能以評價各組試件的表面親水性。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

體外復(fù)蘇MC3T3?E1 成骨細(xì)胞，加入α?MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青?鏈霉素），于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、95% 相對濕度、5% CO2）內(nèi)靜置培養(yǎng)。每3 d換液，細(xì)胞密度達(dá)80%后1∶4傳代。

1.2.4 細(xì)胞黏附觀察

選用直徑5 mm、厚1 mm的純鈦片打磨拋光、超聲清洗后置于96 孔板中，分別以空氣、生理鹽水、BSA 溶液、Ag2S@BSA 溶液密閉存儲2 周，棄存儲液后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞（5×103個/孔）接種于4 組材料表面孵育8 h，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，鬼筆環(huán)肽室溫下避光染色30 min，DAPI 室溫下避光染色2 min。激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取視野觀察各組試件表面細(xì)胞黏附形態(tài)。

1.2.5 CCK?8法檢測細(xì)胞增殖活性

每組各選用3枚純鈦片置于96孔板中，分別以4 種介質(zhì)密閉存儲2 周，棄存儲液后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞（2×103個/孔）接種于4組試件表面。培養(yǎng)1、3、6 d后，加入200 μL新鮮配制的CCK?8 液37 ℃孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀檢測各孔在波長450 nm下的吸光度。

1.2.6 蛋白印跡法（Western blot）檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

將4 組鈦片置于6 孔板中，在4 種條件下保存2 周后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1 細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于4組鈦片表面培養(yǎng)7 d后，提取細(xì)胞總蛋白。以GAPDH 為內(nèi)參，Western blot 檢測成骨分化相關(guān)蛋白骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、骨鈣蛋白（osteo?calcin，OCN）的表達(dá)水平，Photoshop 軟件測定蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.7 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測

將4 組鈦片置于6 孔板中，分別以不同介質(zhì)保存2 周，棄存儲液后用PBS 漂洗3 遍，將MC3T3?E1細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于4組鈦片表面培養(yǎng)7 d后，RIPA冰上裂解30 min，收集裂解液離心后取上清，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，堿性磷酸酶測試盒測定ALP活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對親水性、細(xì)胞增殖、ALP活性和蛋白相對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，顯示方差齊，進(jìn)行單因素方差分析和SNK 多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表面微形貌

掃描電鏡觀察純鈦試件在4種介質(zhì)中存儲2周后的表面形貌見圖1。低倍鏡下觀察4 組試件表面平坦，均可見整齊的機(jī)械劃痕。高倍鏡下生理鹽水組鈦表面可見散在分布的晶體，Ag2S@BSA 組鈦表面均勻分布納米級顆粒。該結(jié)果表明，鈦表面經(jīng)4種介質(zhì)存儲2 周后，表面微形貌無明顯改變，Ag2S@BSA 溶液浸泡后可形成大小均一的納米級顆粒吸附于鈦片表面。

圖1 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲2周后的掃描電鏡圖像Figure 1 SEM images of titanium specimens stored in different media for 2 weeks

2.2 表面元素分析

4組純鈦試件表面元素的EDS面分析結(jié)果如圖2 所示。各組試件表面均含有鈦、氧、碳元素，生理鹽水組可見散在重疊分布的鈉、氯元素，表明鈦片表面經(jīng)生理鹽水浸泡后散在分布氯化鈉晶體。BSA組表面相比空氣組和生理鹽水組碳元素和氧元素的分布更均勻密集，提示以碳元素和氧元素為主要組成元素的BSA 均勻吸附于鈦片表面。Ag2S@BSA組可見與顆粒重疊分布的銀元素和硫元素，提示含有Ag2S的納米顆粒形成并均勻吸附于鈦片表面。

圖2 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲2周后的EDS面分析圖像（×10 000）Figure 2 EDS mapping images of titanium surfaces stored in different media for 2 weeks（×10 000）

2.3 接觸角和表面能

4組純鈦試件的接觸角和表面能測量結(jié)果見圖3。生理鹽水組和BSA 組與空氣組相比接觸角減小，表面能增大，生理鹽水組和BSA 組間無統(tǒng)計學(xué)差異。Ag2S@BSA 組與其余3 組相比接觸角明顯減小，表面能明顯增大，提示鈦表面的親水性得到了更好的留存。

圖3 純鈦試件在不同介質(zhì)中存儲2周后的接觸角和表面能Figure 3 Contact angle and surface energy of titanium specimens stored in different media for 2 weeks

2.4 細(xì)胞黏附觀察

4組試件表面接種MC3T3?E1細(xì)胞培養(yǎng)8 h后的黏附形態(tài)見圖4。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，空氣組黏附細(xì)胞較少，形態(tài)較為縮窄，生理鹽水組較空氣組鋪展稍大，BSA組較空氣組和生理鹽水組黏附細(xì)胞鋪展更為充分，Ag2S@BSA 組黏附細(xì)胞數(shù)量最多，鋪展充分，細(xì)胞偽足多而長。結(jié)果表明Ag2S@BSA組促進(jìn)MC3T3?E1細(xì)胞黏附的作用最明顯。

圖4 四種介質(zhì)存儲后的鈦表面接種成骨細(xì)胞孵育8 h后的細(xì)胞黏附形態(tài)（×200）Figure 4 Adhesion morphology of osteoblasts cultured for 8 hours on titanium surfaces stored in four media（×200）

2.5 細(xì)胞增殖活性

4 組試件表面培養(yǎng)MC3T3?E1 細(xì)胞的增殖活性如圖5 所示。第1、3 天，各組吸光度值無明顯差異（P＞0.05）。培養(yǎng)6 d 后，生理鹽水組、BSA 組和Ag2S@BSA 組與空氣組相比吸光度值增高（P＜0.05），其中，Ag2S@BSA組吸光度值較生理鹽水組更高（P＜0.05），與BSA 組之間無顯著差異（P＞0.05）。該結(jié)果提示，與空氣組相比，經(jīng)3種液體存儲后的鈦表面均能促進(jìn)MC3T3?E1 細(xì)胞的增殖活性，其中Ag2S@BSA組的促進(jìn)作用相對明顯。

圖5 四種介質(zhì)存儲后的鈦表面接種成骨細(xì)胞1、3、6 d后的細(xì)胞增殖活性結(jié)果Figure 5 Proliferation of osteoblasts cultured for 1，3，and 6 days on titanium surfaces stored in four media

2.6 成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

4組鈦片表面接種MC3T3?E1細(xì)胞7 d后表達(dá)成骨相關(guān)蛋白的Western blot 條帶和灰度值比較結(jié)果見圖6。各組之間MC3T3?E1 細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，OPN、OSX、OCN 的相對表達(dá)水平由高到低依次為Ag2S@BSA組＞BSA組＞生理鹽水組＞空氣組。該結(jié)果表明，經(jīng)液體存儲后的鈦片表面增強(qiáng)了MC3T3?E1細(xì)胞的成骨分化活性，其中Ag2S@BSA組的促進(jìn)作用最明顯。

圖6 Western blot檢測4種介質(zhì)存儲后的鈦表面接種成骨細(xì)胞7 d后的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 Osteogenesis?related protein expression in osteo?blasts cultured for 7 days on titanium surfaces stored in four media Western blotting

2.7 ALP活性

4組試件表面接種MC3T3?E1細(xì)胞7 d后的ALP活性檢測結(jié)果見圖7。相比空氣組，經(jīng)3種液體保存后的鈦片表面成骨細(xì)胞ALP 活性均有不同程度升高，其中BSA 組和Ag2S@BSA 組ALP 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。結(jié)果提示，經(jīng)液體存儲后的鈦片表面MC3T3?E1 細(xì)胞成骨分化活性增強(qiáng)，且BSA 組和Ag2S@BSA組更為顯著。

圖7 4種介質(zhì)存儲后的鈦表面接種成骨細(xì)胞7 d后的ALP活性Figure 7 The ALP activity of osteoblasts incubated for 7 days on titanium specimens stored in four me?dia

3 討論

近年來我國種植體植入數(shù)量逐年增長，成品純鈦種植體通常保存在封閉的無菌包裝盒或生理鹽水中。純鈦表面暴露于空氣中可快速形成二氧化鈦層并吸附碳?xì)浠衔?，生成一層致密的氧化膜從而降低材料的親水性［16］。Hori 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，純鈦、酸蝕和噴砂鈦表面隨著貯存時間的延長均存在生物老化過程，表面親水性逐漸轉(zhuǎn)為疏水性，且3種表面的蛋白吸附量與親水性成正相關(guān)。因此，如何改進(jìn)鈦種植體存儲方法，提高鈦表面親水性亟待研究。

為探索新型的種植體存儲媒介，本實驗將BSA包裹的Ag2S 納米顆粒用于鈦表面存儲，以空氣、生理鹽水、BSA溶液為對照組，研究4種存儲介質(zhì)對純鈦表面特性及成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。打磨拋光的純鈦片置于4種介質(zhì)中存儲2周后于掃描電鏡下觀察，4組鈦片表面均呈現(xiàn)整齊的機(jī)械劃痕，表明不同存儲介質(zhì)保存后不會影響鈦片表面形貌。高倍鏡下可見Ag2S@BSA組鈦表面均勻吸附大小均一的納米級顆粒，而BSA組未見明顯變化，提示BSA包裹Ag2S 后聚集成核，體積增大。對比4 組試件的接觸角發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同溶液存儲后的鈦表面親水性與空氣組相比均有不同程度的提升，其中Ag2S@BSA 組接觸角最小，表面能最大。分析其原因可能是液體存儲隔絕了鈦表面的二氧化鈦層與空氣的接觸，減少鈦表面的碳累積，其中Ag2S@BSA組形成的納米級顆粒在鈦片表面均勻密集地吸附，使鈦表面的親水性得到更好地留存。

在不同介質(zhì)存儲2 周后的鈦表面培養(yǎng)MC3T3?E1細(xì)胞后的CEK?8結(jié)果顯示，經(jīng)過不同溶液存儲后的鈦表面成骨細(xì)胞的增殖活性較空氣組均有不同程度的改善，其中Ag2S@BSA 組相對更佳。提示BSA 包裹Ag2S以納米顆粒的形式吸附于鈦片表面，限制了其活動性，消除了Ag2S的細(xì)胞毒副作用。表面修飾劑是硫化物納米粒子合成過程中控制粒徑大小和分布的關(guān)鍵，BSA因其良好的生物相容性和酶穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用為穩(wěn)定劑和修飾劑［18］。BSA 包裹后的金屬硫化物生物毒性降低，表面活性增強(qiáng)，且具有良好的尺寸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性［19］。有研究證明，BSA、腐殖質(zhì)、藻酸鹽等天然有機(jī)質(zhì)包覆可以通過穩(wěn)定Ag2S納米顆粒、減少其與細(xì)胞相互作用造成的細(xì)胞膜損傷程度來減輕納米材料的毒性，其中BSA包覆層最厚，對細(xì)胞膜損傷程度最?。?0］。

激光共聚焦、ALP 活性和Western blot 結(jié)果表明，Ag2S@BSA 組成骨細(xì)胞的黏附和成骨分化活性顯著提升，可能與鈦表面親水性的增加和蛋白吸附有關(guān)［21］。Calciolari 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，親水性鈦表面通過調(diào)控特異性信號通路、血管內(nèi)皮生長因子和有絲分裂原活化蛋白激酶等途徑促進(jìn)血管生成、骨礦化和骨重建。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，親水性種植體早期成骨反應(yīng)增強(qiáng)，炎癥反應(yīng)降低［23］。這歸因于血清中的生物活性因子在親水性鈦表面快速擴(kuò)散，通過調(diào)節(jié)吸附蛋白量、構(gòu)象和結(jié)合強(qiáng)度促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化［24］。蛋白吸附在骨整合過程中至關(guān)重要，種植體在植入后幾毫秒內(nèi)血液即可快速擴(kuò)散，蛋白吸附于鈦表面形成生物活性修飾，進(jìn)而影響后續(xù)的細(xì)胞黏附、增殖和擴(kuò)散［25］。選用血漿蛋白對不同形貌和潤濕性的鈦種植體進(jìn)行吸附研究發(fā)現(xiàn)，親水性表面促進(jìn)了蛋白質(zhì)的選擇性吸附，增強(qiáng)了細(xì)胞黏附、增殖等生物學(xué)行為［26］。

綜上所述，本研究以BSA 為穩(wěn)定劑制備包裹Ag2S 的納米顆粒用于純鈦表面的存儲，結(jié)果表明，Ag2S@BSA 溶液存儲后的純鈦表面親水性和表面能增加，對成骨細(xì)胞無明顯毒性作用，且能促進(jìn)其黏附、增殖和成骨分化。本研究結(jié)果可為新型種植體存儲液的研發(fā)提供新的思路，后續(xù)研究將對其最優(yōu)濃度和銀離子釋放產(chǎn)生的抗菌性能進(jìn)行更深入的探索。