莊 歡，朱曉磊，吳曉琴，張 慶，方 靖，吳池華

乳腺癌是全世界女性與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因，全世界每年有將近140萬婦女被診斷出患有這種疾病，每年超過45萬例死亡。乳腺癌最常用的治療方法是手術(shù)切除腫瘤，輔以輔助化療或放療。盡管在乳腺癌的早期檢測和治療方面取得了進步，但乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍逐年上升，迫切需要發(fā)現(xiàn)乳腺癌的診斷和治療新靶標(biāo)用于治療乳腺癌。

微小RNA( microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼調(diào)控RNA，在乳腺癌中起癌基因或抑癌作用。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 (colon cancer associated transcript 1，CCAT1)是2012年在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種新型LncRNA，被證實在乳腺癌中高表達，與乳腺癌組織分化程度，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。相關(guān)研究表明絲裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)在婦科腫瘤干細胞中高表達，對于維持腫瘤干細胞致癌能力有一定的作用。但CCAT1與MAPK13對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚。該文旨在探究LncCCAT1競爭性結(jié)合miR-583p通過調(diào)節(jié)MAPK13的表達對MCF-7細胞干性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：61870-127)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號：26400-036)、青-鏈霉素(批號：15140-122)、胰蛋白酶(批號：25200-056)、F12培養(yǎng)基(批號：21700-075)購自美國Gibco公司；牛血清白蛋白(Bovine albumin，BSA，批號：ST025)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，批號：C0221A)、LipoRNAi轉(zhuǎn)染試劑(批號：C0535)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；熒光素酶(批號：L7840)檢測試劑盒購自北京solarbio公司；Anti MAPK13(貨號：ab236738)、SOX2(貨號：ab97959)、NANOG(貨號：ab80892)、ALDH1(貨號：ab87117)、GAPDH(貨號：ab9485)購自英國Abcam公司。

1.2 細胞處理

人乳腺癌細胞MCF-7來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10% FBS和1%青-鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)。參照胡楠 等方法分離乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSCs)，用PBS洗去血清，懸浮培養(yǎng)于無FBS的含5 mg/L胰島素，10 μg/L重組人堿性成纖維細胞生長因子，20 μg/L表皮細胞生長因子，0.04% BSA的無酚紅DMED-F12培養(yǎng)基中。傳代時每次1×10個細胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，用低速離心機分離微球，胰酶消化，離心除去胰酶，重懸于無血清培養(yǎng)基中。微球直徑長至80 μm之前傳代，每5 d傳代1次。

1.3 q-PCR法

使用TRIzol試劑按照試劑說明書從MCF-7細胞中分離總RNA，然后用BeyoRTcDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，用BeyoFastSYBR Green qPCR Mix在PCR儀上進行測定，用2方法計算。檢測貼壁細胞、懸浮球細胞和再貼壁細胞中CCAT1和miR-583p表達水平。

1.4 細胞分組

為了防止脫靶效應(yīng)，設(shè)計了3對shRNA序列干擾CCAT1的表達，通過q-PCR檢測選擇效果最好的sh-CCAT1-2進行后續(xù)試驗。用miR-583p mimc或miR-583p inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細胞以過表達或低表達miR-583p，q-PCR檢測miR-583p表達水平。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，構(gòu)建shRNA CCAT1載體，采用LipoRNAi轉(zhuǎn)染試劑將sh-CCAT1和miR-583p inhibitor單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，將細胞隨機分為4組：對照、shRNA-CCAT1-2、miR-583p inhibitor和shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor組。

1.5 熒光素酶報告實驗

為了檢測CCAT1是否為miR-583p的直接下游靶基因，選用熒光素酶報告分析。通過miRDB預(yù)測LncCCAT1和miR-583p的靶向關(guān)系，構(gòu)建野生型和突變型CCAT1 3、UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒。按照熒光素酶檢測試劑盒進行檢測。

1.6 ALDEFLUOR分析

采用ALDEFLUOR分析方法對乳腺癌細胞MCF-7 ALDH活性進行分析，根據(jù)ALDEFLUOR試劑盒說明書進行檢測：40 μm濾器收集細胞球，胰酶消化8 min，反復(fù)吹打10次懸浮于含5 μl的ALDH底物BodipyTM-aminoacetaldehyde中，37 ℃孵育40 min。將等分試樣加入5 μl處理過的ALDH抑制劑DEAB，重懸于孵育緩沖液中，用流式細胞儀進行檢測。

1.7 成球?qū)嶒?

將各組細胞經(jīng)流式細胞儀計數(shù)后鋪至超低黏附96孔板。每孔100 μl F12成球培養(yǎng)基，含10個活細胞，各鋪10個復(fù)孔。靜置培養(yǎng)14 d后倒置顯微鏡下觀察成球直徑。

1.8 Western blot

取對數(shù)生長期的各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品， 100 ℃變性5 min，SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜，4 ℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。

1.9 MAPK13過表達對MCF-7細胞的影響

通過miRDB預(yù)測MAPK13和miR-583p的靶向關(guān)系，構(gòu)建慢病毒LV-MAPK13并轉(zhuǎn)染MCF-7細胞過表達MAPK13，q-PCR檢測MAPK13水平。采用LipoRNAi轉(zhuǎn)染試劑將shRNA-CCAT1-2和LV-MAPK13單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，將細胞隨機分為4組：對照、shRNA-CCAT1-2、LV-MAPK13和shRNA-CCAT1-2+LV-MAPK13組，shRNA-CCAT1-2組轉(zhuǎn)染shRNA-CCAT1-2，LV-MAPK13組細胞轉(zhuǎn)染LV-MAPK13，shRNA-CCAT1-2+LV-MAPK13組細胞同時轉(zhuǎn)染shRNA-CCAT1-2和LV-MAPK13。Western blot檢測MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 LncCCAT1和miR-583p表達水平

通過q-PCR檢測CCAT1和miR-583p表達水平結(jié)果如圖1所示，與貼壁細胞相比較，懸浮球細胞CCAT1表達水平升高(

t

=1.741，

P

<0.05)，miR-583p表達水平降低(

t

=1.564，

P

<0.05)。

2.2 miR-583p和CCAT1靶向關(guān)系

通過q-PCR檢測3個CCAT1 shRNA中CCAT1水平結(jié)果如圖2B所示，與對照組相比，shRNA-CCAT1-1、shRNA-CCAT1-3組CCAT1水平降低(

F

=59.15，

P

<0.05)，shRNA-CCAT1-2組CCAT1水平降低(

t

=1.381，

P

<0.01)，選擇shRNA-CCAT1-2進行后續(xù)實驗；分別用miR-583p mimic或miR-583p inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細胞以過表達或低表達miR-583p，q-PCR檢測miR-583p表達水平結(jié)果如圖2C、D所示，與對照組相比，miR-583p mimc組miR-583p表達水平升高(

t

=1.049，

P

<0.001)，miR-583p inhibitor組miR-583p表達水平升高(

t

=1.299，

P

<0.01)；通過shRNA-CCAT1-2和miR-583p inhibitor單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，q-PCR法檢測miR-583p的表達情況結(jié)果如圖2E所示，與對照組相比，shRNA-CCAT1-2組miR-583p表達水平升高(

t

=1.709，

P

<0.01)，miR-583p inhibitor組miR-583p表達水平降低(

t

=1.299，

P

<0.01)。與miR-583p inhibitor組相比較，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor組miR-583p表達水平升高(

t

=1.325，

P

<0.01)。為明確miR-583p對CCAT1的靶向關(guān)系，采用熒光素酶實驗檢測，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得CCAT1 3′UTR序列如圖2A所示，CCAT1 WT加入miR-583p mimic處理后熒光素酶活性降低(

t

=2.441，

P

<0.01，圖2F)，結(jié)果證明miR-583p和CCAT1存在直接靶向作用關(guān)系。

2.3 LncCCAT1競爭性結(jié)合miR-583p降低MCF-7細胞ALDH活性及SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達水平

通過ALDEFLUOR分析檢測干細胞和祖細胞的酶標(biāo)記物乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)活性結(jié)果如圖3A所示，對照組ALDH活性高于shRNA-CCAT1-2組，低于miR-583p inhibitor組。shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor組ALDH活性低于miR-583p inhibitor組；通過Western blot檢測各組細胞SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達水平結(jié)果如圖3B所示，與對照組相比，shRNA-CCAT1-2組SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

t

=1.519、1.550、2.250，

P

<0.05)，miR-583p inhibitor組SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平升高(

t

=6.913、4.000、4.120，

P

<0.05)。與miR-583p inhibitor組相比，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor組SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

t

=2.792、2.208、2.556，

P

<0.05)。

圖1 LncCCAT1和miR-583p表達水平

圖2 miR-583p和CCAT1靶向關(guān)系

圖3 LncCCAT1競爭性結(jié)合miR-583p對MCF-7細胞ALDH活性及SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達水平的影響

2.4 LncCCAT1競爭性結(jié)合miR-583p降低MCF-7細胞成球直徑

通過成球?qū)嶒灆z測各組細胞成球直徑結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，shRNA-CCAT1-2組成球直徑降低(

t

=1.933，

P

<0.05)，miR-583p inhibitor組成球直徑升高(

t

=4.882，

P

<0.05)。與miR-583p inhibitor組相比，shRNA-CCAT1-2+miR-583p inhibitor組成球直徑降低(

t

=2.774，

P

<0.05)。

2.5 MAPK13過表達對MCF-7細胞的影響

為明確miR-583p對MAPK13的靶向關(guān)系，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得MAPK13 3′UTR序列如圖5A所示，采用熒光素酶實驗檢測，MAPK13 wt加入miR-583p mimic處理后熒光素酶活性降低(

t

=1.889，

P

<0.01，圖5B)，表明miR-583p與MAPK13存在直接靶向作用關(guān)系；構(gòu)建慢病毒LV-MAPK13并轉(zhuǎn)染MCF-7細胞過表達MAPK13，q-PCR檢測各組細胞MAPK13水平結(jié)果圖5C、D所示，與貼壁細胞相比，懸浮球細胞MAPK13水平升高(

t

=2.053，

P

<0.01)。與對照組相比，LV-MAPK13組MAPK13水平升高(

t

=1.604，

P

<0.001)；通過Western blot檢測各組細胞MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達水平結(jié)果如圖5E所示，與對照組相比，shRNA-CCAT1-2組LV-MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

t

=1.550、1.519、1.550、2.250，

P

<0.05)，LV-MAPK13組MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平升高(

t

=1.391、1.889、1.911、1.375，

P

<0.05)。與LV-MAPK13組相比，sh-CCAT1+MAPK13組MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白水平降低(

t

=1.237、1.570、1.587、1.225，

P

<0.05)。

圖4 LncCCAT1競爭性結(jié)合miR-583p對MCF-7細胞成球直徑的影響

3 討論

長鏈非編碼RNA是一類長度超過200個核苷酸序列的非編碼RNA，其異常表達與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān),如細胞增殖、侵襲和自噬等。Han et al發(fā)現(xiàn)CCAT1在三陰性乳腺癌腫瘤組織及細胞系中高表達，促進三陰性乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移。LncRNA和miRNA間存在著緊密的調(diào)控關(guān)系，LncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源RNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達調(diào)控，已被證實在乳腺癌的發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移及耐藥中起重要作用。Lai et al表明CCAT1下調(diào)通過負(fù)向調(diào)控miR-148b表達，減少癌細胞集落形成率，促進細胞凋亡，從而提高乳腺癌細胞的放射敏感性。

腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中具有自我更新能力的細胞，其可分化成為不同家族的腫瘤細胞構(gòu)成整個腫瘤。腫瘤細胞獲得干細胞表型后具有較強的成球能力，并分化成其他類型的腫瘤細胞，腫瘤干細胞表型的獲得是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特性，也是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素之一。靶向腫瘤干細胞是治療癌癥的有效途徑之一。本文表明，沉默CCAT1表達降低MCF-7細胞成球直徑，抑制miR-583p表達則升高MCF-7細胞成球直徑，并且減弱sh-CCAT1對MCF-7細胞成球直徑的抑制作用，表明CCAT1能升高MCF-7細胞成球直徑，并且其作用機制與其下調(diào)miR-583p表達有關(guān)。

P38δ MAPK也稱為MAPK13，是脂肪細胞分化的主要候選基因。p38蛋白激酶是MAPK通路中控制炎癥反應(yīng)最重要的一條，通過介導(dǎo)癌細胞黏著、增強乳腺癌細胞運動性等機制，促進乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。SOX2是SOX基因家族的一員，是癌癥干細胞標(biāo)志物，在維持干細胞多能性方面起著重要作用，參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等過程。Wang et al表明SOX2在乳腺癌組織中高表達。NANOG是含同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細胞干性維持和自我更新中起作用，在干細胞中表達，在分化成熟細胞中表達缺失，可促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，相關(guān)研究表明NANOG在乳腺癌癌組織中表達升高。ALDH1屬于細胞內(nèi)乙醛氧化脫氫酶，是干細胞生長、分化的必需物質(zhì)，可作為腫瘤干細胞的標(biāo)記物。研究表明乳腺癌細胞ALDH1表達上調(diào), 則其增殖分化能力、集落形成能力、黏附能力、遷移能力和侵襲能力都會不同程度的增強。本文顯示沉默CCAT1的表達可抑制MAPK13、SOX2、NANOG、ALDH1蛋白的表達，miR-583p inhibitor或LV-MAPK13能明顯減弱sh-CCAT1對細胞SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達的抑制作用。提示沉默CCAT1表達后，CCAT1對miR-583p或LV-MAPK13的抑制作用消失，miR-583p或MAPK13的表達抑制SOX2、NANOG、ALDH1蛋白表達，表明CCAT1高表達可通過下調(diào)miR-583p或MAPK13的表達抑制SOX2、NANOG、ALDH1蛋白的表達，從而抑制MCF-7細胞干細胞樣特性。

圖5 MAPK13過表達對MCF-7細胞的影響