吳 慢,王先鶴,高 慧,鄧 芳

過敏性紫癜性腎炎(henoch-schnlein purpura nephritis,HSPN)是兒童常見的繼發(fā)性腎小球疾病，可進(jìn)展至終末期腎臟病，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。足細(xì)胞被覆于腎小球基底膜外側(cè)，是腎小球?yàn)V過膜,最終也是腎小球最重要的屏障，HSPN的發(fā)生與足細(xì)胞的損傷有著密切的關(guān)系。瞬時(shí)受體電位非選擇性陽離子通道蛋白(transient receptor potential canonical，TRPC)6位于腎小球足細(xì)胞，是裂隙膜的重要組成部分，TRPC6主要介導(dǎo)Ca內(nèi)流發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HSPN患兒腎內(nèi)存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的異?；罨?，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)作為RAS中主要效應(yīng)分子，可誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞損傷，刺激JAK2/STAT3信號(hào)通路的過表達(dá)引起腎臟炎性。在此過程中，TRPC6也會(huì)過度表達(dá)。另外有研究表明，Ca能夠參與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路。因此，猜測在Ang Ⅱ損傷足細(xì)胞過程中，TRPC6與JAK2/STAT3信號(hào)通路存在一定的相互作用關(guān)系。該研究以此為出發(fā)點(diǎn)來探討在足細(xì)胞中TRPC6通道蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相互作用及其機(jī)制，為腎臟炎癥性疾病防治提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶及轉(zhuǎn)鐵蛋白、Ang Ⅱ(美國Sigma公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(以色列BI公司)； TRPC6受體抑制劑 (SKF96365)、Ang Ⅱ受體抑制劑氯沙坦(ab120997)、JAK2/STAT3通路抑制劑(AG490)(上海abcam公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(日本 Takara公司)；實(shí)時(shí)熒光PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；兔抗TRPC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體(美國CST公司)；兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢三鷹公司)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescent， ECL)試劑盒(上海Tanon公司)；小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、小鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1

小鼠足細(xì)胞(mousepodocyte clone,MPC)的分離和培養(yǎng) MPC細(xì)胞株(購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所系用于全部實(shí))將復(fù)蘇的足細(xì)胞放入 33 ℃、5% CO孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為DMEM低糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清以及補(bǔ)充劑(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉)。當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合時(shí)，轉(zhuǎn)至37 ℃、5% CO孵箱中使用相同的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，至細(xì)胞分化完全，選擇第5～15代分化完全的足細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2

實(shí)驗(yàn)分組 待足細(xì)胞長到70%～80% 融合時(shí)，接種到6孔板中，使每孔細(xì)胞濃度達(dá)到80%后用于實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組：① 對(duì)照組(NC組)；② Ang Ⅱ損傷組：加入Ang Ⅱ,使其濃度保持在1 μmol/L；③ Ang Ⅱ+氯沙坦組：加入Ang Ⅱ和氯沙坦,使其濃度分別保持在1 μmol/L和20 μmol/L；④ Ang Ⅱ+AG490組：加入Ang Ⅱ和AG490,使其濃度分別保持在1 μmol/L和40 μmol/L；⑤ Ang Ⅱ+SKF96365組：加入Ang Ⅱ和SKF96365，使其濃度分別保持在1 μmol/L和40 μmol/L。將上述分組在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

Western blot檢測 取足細(xì)胞置于冰上，PBS清洗3遍后，用干凈的細(xì)胞刷將細(xì)胞刮下并搜集，分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，低溫離心后取上清液，用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸10 min后，每組蛋白取20 μg上樣，用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，濕電轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶-PBST溶液室溫封閉2 h，再用PBS清洗3遍，分別加入一抗JAK2(1 ∶2 000)；P-JAK2(1 ∶2 000)；STAT3(1 ∶2 000)；P-STAT3(1 ∶2 000)；TRPC6(1 ∶5 000)；β-actin(1 ∶35 000)，于4 ℃孵育過夜后，洗膜，顯影，采用β-actin 作為內(nèi)參，系統(tǒng)軟件 Image-J 進(jìn)行灰度分析。

1.2.4

qRT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞 mRNA，并以提取的RNA樣品為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green試劑盒說明書對(duì)cDNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入循環(huán)；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5

ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子含量 收取各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書用ELISA 方法檢測各組細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平。

表1 PCR引物列表

2 結(jié)果

2.1 Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞JAK2/STAT3通路蛋白與TRPC6蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+氯沙坦組的p-JAK2表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.55、

P

=0.001 4)；3組間的p-STAT3表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.40、

P

=0.001 5)；3組間的TRPC6表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=9.73、

P

=0.013 1)。兩兩比較結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ損傷組的p-JAK2、p-STAT3與TRPC6蛋白表達(dá)水平較高(

P

均<0.05)；與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+氯沙坦組p-JAK2、p-STAT3與TRPC6蛋白表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。見圖1。因此，在足細(xì)胞受到Ang Ⅱ刺激時(shí)，JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平與TRPC6蛋白表達(dá)量升高。

2.2 AG490對(duì)足細(xì)胞JAK2/STAT3通路蛋白與TRPC6蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+AG490組的p-JAK2表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=20.83、

P

=0.002)；3組間的p-STAT3表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=12.35、

P

=0.008)；3組間的TRPC6表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=6.546、

P

=0.031)。兩兩比較結(jié)果提示，與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+AG490組的p-JAK2、p-STAT3與TRPC6蛋白表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。見圖2。因此，在AG490對(duì)JAK2/STAT3通路的阻斷下，不僅JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平降低，TRPC6蛋白表達(dá)量也隨著降低。

圖1 Ang Ⅱ作用下JAK2/STAT3通路蛋白

2.3 SKF96365對(duì)足細(xì)胞JAK2/STAT3通路蛋白與TRPC6蛋白的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+SKF96365組的p-JAK2表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=13.03、

P

=0.007)；3組間的p-STAT3表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=9.351、

P

=0.014)；3組間的TRPC6表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=26.47、

P

=0.001)。兩兩比較結(jié)果提示，與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+SKF96365組的p-JAK2、p-STAT3與TRPC6蛋白表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。詳見圖3。因此，在SKF96365對(duì)TRPC6的阻斷下，不僅TRPC6蛋白表達(dá)量降低，JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平也隨著降低。

2.4 Ang Ⅱ及各蛋白阻滯劑對(duì)足細(xì)胞TRPC6 mRNA表達(dá)的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+氯沙坦組的TRPC6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=39.18、

P

<0.001)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+AG490組的TRPC6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=39.61、

P

<0.001)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+SKF96365組的TRPC6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=37.15、

P

<0.001)。兩兩比較結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ損傷組的TRPC6 mRNA表達(dá)水平較高(

P

<0.05)。與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+氯沙坦組、Ang Ⅱ+AG490組和Ang Ⅱ+SKF96365組的 TRPC6 mRNA表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。詳見圖4。因此，對(duì)Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的抑制均能降低TRPC6 mRNA的表達(dá)。

圖2 AG490作用下JAK2/STAT3通路蛋白與TRPC6蛋白表達(dá)量 a：對(duì)照組；b：Ang Ⅱ損傷組；d: Ang Ⅱ+AG490組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，***P<0.001；與Ang Ⅱ損傷組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.5

Ang

Ⅱ及各蛋白阻滯劑對(duì)足細(xì)胞TNF

-

α、IL

-6

mRNA表達(dá)的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+氯沙坦組的TNF-α mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=21.27、

P

=0.002)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+AG490組的TNF-α mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.62、

P

=0.001)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+SKF96365組的TNF-α mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=32.21、

P

<0.001)。兩兩比較結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ損傷組的TNF-α表達(dá)水平較高(

P

<0.05)；與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+氯沙坦組、Ang Ⅱ+AG490組和Ang Ⅱ+SKF96365組的TNF-α mRNA表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+氯沙坦組的IL-6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=29.30、

P

<0.001)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+AG490組的IL-6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.17、

P

=0.002)；對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+SKF96365組的IL-6 mRNA表達(dá)相對(duì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.91、

P

=0.001)。兩兩比較結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ損傷組的IL-6 mRNA表達(dá)水平較高(

P

<0.05)；與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+氯沙坦組、Ang Ⅱ+AG490組和Ang Ⅱ+SKF96365組的IL-6 mRNA表達(dá)水平較低(

P

均<0.05)。詳見圖5。

圖3 SKF96365作用下JAK2/STAT3通路蛋白與TRPC6蛋白表達(dá)量

圖4 Ang Ⅱ刺激及各蛋白阻滯劑處理mpc后TRPC6 mRNA表達(dá)量

圖5 Ang Ⅱ刺激及各蛋白阻滯劑處理mpc后TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量

因此，對(duì)Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的阻斷均能降低炎癥因子TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)。

2.6 Ang Ⅱ及各蛋白阻滯劑對(duì)足細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

對(duì)照組、Ang Ⅱ損傷組、Ang Ⅱ+氯沙坦組、Ang Ⅱ+AG490組、Ang Ⅱ+SKF96365組的TNF-α的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=78.35、

P

<0.001)；各組間IL-6的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=46.30、

P

<0.001)。兩兩比較結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ損傷組的TNF-α、IL-6表達(dá)量較高(

P

均<0.05)；與Ang Ⅱ損傷組相比，Ang Ⅱ+氯沙坦組、Ang Ⅱ+AG490組和Ang Ⅱ+SKF96365組的TNF-α、IL-6表達(dá)量較低(

P

均<0.05)。詳見圖6。因此，對(duì)Ang Ⅱ、JAK2/STAT3和TRPC6的阻斷均能降低炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，與mRNA水平變化趨勢與之一致。

3 討論

HSPN患兒的腎臟損害是影響其預(yù)后的重要因素，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)腎內(nèi) RAS 在腎小球?yàn)V過率的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，HSPN患兒腎內(nèi)存在RAS的異?；罨?，而Ang Ⅱ作為該系統(tǒng)中主要效應(yīng)分子參與了腎臟病理炎癥改變。本研究通過Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞，模擬足細(xì)胞在炎癥中受到的刺激，并通過TRPC6和JAK2/STAT3阻斷劑分別抑制TRPC6和JAK2/STAT3的表達(dá)，來研究TRPC6離子通道蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相互作用與機(jī)制。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果：① Ang Ⅱ通過上調(diào)TRPC6通道蛋白以及JAK2/ATAT3信號(hào)通路產(chǎn)生炎癥因子，使足細(xì)胞損傷：② 通過抑制劑抑制TRPC6通道蛋白能夠下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路的表達(dá)；③ 通過抑制劑抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠下調(diào)TRPC6通道蛋白的表達(dá)；④ 分別使用抑制劑抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路以及TRPC6通道蛋白的同時(shí)，炎癥因子也在減少，足細(xì)胞損傷得到控制。

圖6 不同刺激條件下的TNF-α和IL6蛋白表達(dá)量

小兒HSPN常常伴有大量蛋白尿，具體機(jī)制尚不明確，足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過膜的重要結(jié)構(gòu)，在蛋白尿中發(fā)揮著重要作用。Ang Ⅱ作為炎癥遞質(zhì)能夠作用于足細(xì)胞上足突AT1受體損傷足細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，破壞腎小球?yàn)V過屏障從而產(chǎn)生大量蛋白尿。TRPC6通道是足突細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的重要遞質(zhì)，并參與調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過，其過表達(dá)或功能增強(qiáng)可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，使小鼠腎臟受到損傷而誘發(fā)蛋白尿。TRPC6的表達(dá)與多種細(xì)胞因子有關(guān)，包括nephrin、 podocin、CD 2AP等這些足細(xì)胞骨架蛋白，并且TRPC6能夠結(jié)合并激活Calpain調(diào)節(jié)足突細(xì)胞骨架、參與細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ能夠?qū)е耇RPC6啟動(dòng)子活性增加，TRPC6通道過度表達(dá)，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，本實(shí)驗(yàn)一通過Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞， TRPC6蛋白及mRNA表達(dá)量升高，炎癥因子TNF-α和IL-6隨之增加，從而使足細(xì)胞損傷加重；當(dāng)給予氯沙坦時(shí)，TRPC6及TNF-α和IL-6表達(dá)量下降，足細(xì)胞損傷減輕，從而證實(shí)Ang II能夠介導(dǎo)足細(xì)胞損傷影響TRPC6的表達(dá)。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在炎癥中起著重要的作用，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、生長和凋亡。JAK2/STAT3通路對(duì)心血管系統(tǒng)的影響也很重要，越來越多的證據(jù)表明，JAK2/STAT3通路參與刺激誘導(dǎo)各種心血管并發(fā)癥，包括凋亡、網(wǎng)狀應(yīng)激、ROS、收縮功能障礙和炎癥。有研究表明，Ang Ⅱ能夠在多種疾病中激活JAK2/STAT3通路，損傷靶細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥因子，本實(shí)驗(yàn)通過Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞，p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)增高，炎癥因子TNF-α和IL-6也隨之增加，足細(xì)胞受到損傷；當(dāng)給予氯沙坦時(shí)，p-JAK2、p-STAT3及TNF-α和IL-6表達(dá)量下降，足細(xì)胞損傷減少，從而證實(shí)Ang II能夠介導(dǎo)足細(xì)胞損傷影響JAK2/STAT3通路的表達(dá)同時(shí)，TRPC6也能夠與多種信號(hào)通路發(fā)生作用。TRPC6作為一種非選擇性的陽離子通道蛋白，主要介導(dǎo)Ca內(nèi)流發(fā)揮作用，并且Ca能夠參與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路。因此，猜測在Ang Ⅱ損傷足細(xì)胞過程中，TRPC6與JAK2/STAT3信號(hào)通路存在一定的相互作用關(guān)系。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)來探討在足細(xì)胞中TRPC6通道蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相互作用及其機(jī)制。通過分別加入TRPC6通道蛋白與JAK2/STAT3通路蛋白抑制劑，用Western blot、q-PCR、ELISA等實(shí)驗(yàn)方法檢測兩者蛋白、mRNA、及細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)量來驗(yàn)證兩者的關(guān)系。結(jié)果顯示，當(dāng)加入SKF96365時(shí)能夠下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白磷酸化的表達(dá)，腎臟炎癥因子隨之減少，足細(xì)胞損傷得以減輕；當(dāng)加入AG490時(shí)，TRPC6通道蛋白以及mRNA的表達(dá)也在減少，其腎臟炎癥因子TNF-α和IL-6也隨之減少，足細(xì)胞損傷得到改善。但兩者的具體聯(lián)系是否通過Ca介導(dǎo)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述， Ang Ⅱ能夠介導(dǎo)TRPC6通道蛋白激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路也能下調(diào)TRPC6通道蛋白的表達(dá)，為腎臟疾病的研究提供了一個(gè)新的方向。