(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤研究所，2.2018級臨床醫(yī)學(xué)系，湖南省衡陽市 421001)

胃癌是一種常見的全球性癌癥[1]，人們一直在孜孜不倦地探尋其發(fā)病機(jī)理。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)假說認(rèn)為,一群占比不高卻具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞驅(qū)動了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為癌癥的深入闡明提供了新思路[2-6]。手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)的治療策略以盡可能多清除癌細(xì)胞為目標(biāo)，但腫瘤干細(xì)胞難以徹底殺死，導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此靶向消滅這類具有干細(xì)胞特性的胃癌細(xì)胞是胃癌治愈的切入點。

大蒜對腫瘤的有效殺滅作用主要依賴于其中所含的二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)，DADS的作用效果涉及對多種惡性生物學(xué)行為的抑制，是一種很有潛力的癌癥治療候選物[7-8]。本研究首先運(yùn)用免疫磁珠分選技術(shù)從AGS胃癌細(xì)胞中分選富集CD44+細(xì)胞；接著經(jīng)腫瘤球形成檢測其干樣特性、Transwell實驗評估細(xì)胞遷移與侵襲效果；最后經(jīng)DADS處理，通過MTT、軟瓊脂培養(yǎng)、流式儀等觀察CD44+亞群的生長與周期分布情況，初步闡明DADS抑制人胃癌干樣細(xì)胞生長的能力，以便進(jìn)一步理解DADS對抗胃癌的治療潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

二烯丙基二硫(DADS)由Fluka公司生產(chǎn)，純度80%。DMEM/F12培養(yǎng)基(1∶1)為賽默飛世生物化學(xué)制品(北京)有限公司出品。CD44包被磁珠購于Miltenyi Biotec公司。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)均為eBioscience公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的鼠抗人CD44抗體和FITC標(biāo)記的鼠抗IgG2b同型對照抗體均購于Biolegend公司。B27培養(yǎng)基添加劑購于Invitrogen公司。Matrigel基質(zhì)膠由美國BD公司生產(chǎn)，Transwell小室屬于Corning產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分選

AGS細(xì)胞株來源于上海市中科院細(xì)胞庫。采用磁激活細(xì)胞分選法(magneticallyactivated cell sorting，MACS)分選AGS細(xì)胞中CD44+亞群，為CD44+組；未分選細(xì)胞為AGS組。于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測CD44陽性率

首先用PBS洗滌未分選的AGS細(xì)胞和分選后的CD44+細(xì)胞，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×108個/L，加入FITC標(biāo)記的CD44抗體，以錫箔紙包裹于4 ℃靜置5 min。洗滌離心去除殘液，2%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱存放24 h，流式儀(Beckerman coulter EPICS-XL)測細(xì)胞CD44陽性率。

1.4 腫瘤球形成能力實驗

成球培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)基+1 mg/L EGF+1 mg/L bFGF)分別將未分選的AGS細(xì)胞和分選后的CD44+細(xì)胞配成1×105個/L單細(xì)胞懸液，96孔板中以100 μL/孔鋪板，取10個復(fù)孔。培育14天后，在倒置顯微鏡下查看成球狀態(tài)，拍照，實驗重復(fù)3次。

1.5 Transwell遷移及侵襲實驗

使用無血清DMEM培養(yǎng)基將Matrigell膠制成5倍稀釋液，混勻后在Transwell上室中加40 μL/孔并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中待其凝固。將凝好的Matrigell膠以無血清DMEM培養(yǎng)基潤洗1次，其上種2.0×104個細(xì)胞備用。在24孔板中加入含血清(10%FBS)的DMEM培養(yǎng)基500 μL/孔后放入小室，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。取出小室，以PBS清洗、棉球拭去上室殘液、干燥、固定(4%多聚甲醛)、染色(結(jié)晶紫)。鏡下觀察、拍照并計數(shù)統(tǒng)計，實驗重復(fù)3次。遷移實驗不用Matrigell膠，其余步驟同上。

1.6 MTT實驗

取對數(shù)生長細(xì)胞，接種至96孔板，加入不同質(zhì)量濃度(20、30、40、50、60 mg/L)DADS，每組6個復(fù)孔，設(shè)不加DADS的為對照組，置5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。每孔加20 μL MTT溶液,培養(yǎng)4 h后棄上清液,加150 μL/孔二甲基亞砜，搖勻。10 min后置酶標(biāo)儀測定OD490。重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-ODCD44+組/ODAGS組)×100%。

1.7 軟瓊脂集落形成實驗

6孔板中鋪底層瓊脂凝膠(3%瓊脂與含10%FBS DMEM培養(yǎng)基以1∶5混勻)1.5 mL/孔備用。收集CD44+細(xì)胞，不加DADS的為對照組；加入不同質(zhì)量濃度(30、60 mg/L)DADS的為DADS組。將各組細(xì)胞制成1×108個/L單細(xì)胞懸液；鋪上層膠(3%瓊脂與含10%FBS DMEM培養(yǎng)基以1∶9配置，加入100 μL細(xì)胞懸液吹勻)1 mL/孔。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后，倒置顯微鏡下拍照，統(tǒng)計細(xì)胞成團(tuán)數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

CD44+細(xì)胞接種于兩塊6孔板，DADS組加入不同質(zhì)量濃度(30、60 mg/L)DADS；不加DADS的為對照組。PBS、75%乙醇預(yù)冷備用。分別于DADS處理24 h、48 h后取出相應(yīng)孔板收集各組細(xì)胞。75%乙醇充分懸浮細(xì)胞進(jìn)行固定；離心去除殘液，加50 μL RNA酶裂解30 min；加50 μL碘化丙啶(PI)混勻靜置30 min(此過程需避光)；用流式細(xì)胞儀計數(shù)1×104個細(xì)胞，分析細(xì)胞周期分布。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AGS細(xì)胞中分選CD44+細(xì)胞

胃癌細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例為2.8%，MACS分選后的CD44+比例為99.9%，表明MACS技術(shù)從AGS細(xì)胞中富集了純度高的CD44+干樣細(xì)胞(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測兩組CD44+表達(dá)結(jié)果

2.2 CD44+細(xì)胞腫瘤球形成能力的比較

分選前后的胃癌細(xì)胞均接種于無血清培養(yǎng)基。CD44+細(xì)胞培養(yǎng)2周后可見典型的腫瘤球形成，同期未經(jīng)分選的AGS細(xì)胞發(fā)生部分細(xì)胞崩解死亡，未見明顯腫瘤球形成(圖2)。以上結(jié)果提示CD44+細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。

圖2 AGS細(xì)胞分選前后腫瘤球形成情況的比較(100×)

2.3 CD44+細(xì)胞遷移能力的比較

與未分選的AGS細(xì)胞比較，分選后的CD44+細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞量明顯增多(P<0.05；圖3)，說明CD44+干樣細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。

圖3 兩組細(xì)胞遷移能力的比較(結(jié)晶紫染色，100×)a為P<0.05，與AGS組比較。

2.4 CD44+細(xì)胞侵襲能力的比較

相較于未分選的AGS組，侵入微孔膜下層的CD44+干樣細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05；圖4)，CD44+干樣細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性。

圖4 兩組細(xì)胞侵襲能力的比較(結(jié)晶紫染色，100×)a為P<0.05，與AGS組比較。

2.5 DADS對CD44+干樣細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度(20、30、40、50、60 mg/L)DADS處理48 h后，CD44+細(xì)胞OD490比對照組低，且隨著質(zhì)量濃度增加OD490逐漸降低，抑制率明顯上升(P<0.05；表1)。

表1 不同質(zhì)量濃度DADS對CD44+干樣細(xì)胞增殖的影響

2.6 DADS對CD44+干樣細(xì)胞集落形成能力的影響

與對照組比較，30 mg/L和60 mg/L DADS處理后集落形成數(shù)明顯減少(P<0.05；表2)。在集落形態(tài)上，對照組集落大，集落數(shù)多，而30 mg/L和60 mg/L DADS處理后可見集落直徑明顯變小，集落數(shù)目減少(圖5)。以上說明，DADS對CD44+細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。

表2 不同質(zhì)量濃度DADS對CD44+干樣細(xì)胞集落形成的影響

圖5 DADS對CD44+干樣細(xì)胞集落形成能力的影響(40×)

2.7 DADS對CD44+干樣細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)(圖6和表3)，DADS(30 mg/L和60 mg/L)分別加入CD44+細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞周期分布G2/M期百分比顯著高于對照組(P<0.05)，且同時段60 mg/L組高于30 mg/L組，同質(zhì)量濃度處理48 h組高于24 h組，表明DADS處理可導(dǎo)致CD44+細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

表3 不同質(zhì)量濃度DADS對CD44+細(xì)胞周期的影響 單位：%

圖6 DADS對CD44+細(xì)胞周期分布的影響

3 討 論

“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”為惡性腫瘤的防治研究提供了新策略。上個世紀(jì)90年代有研究者首次分離出具有干細(xì)胞特點的CD34+/CD38-白血病細(xì)胞[9]，后續(xù)包括胃癌在內(nèi)的實體瘤中也找到了具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群[2-6,10]。據(jù)報道，CD44在多種胃癌細(xì)胞中可作為干樣細(xì)胞的分選標(biāo)志物[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，人胃癌AGS細(xì)胞中CD44+細(xì)胞占比2.8%。說明CD44+細(xì)胞是AGS細(xì)胞中含量較少的一個亞群，CD44包被磁珠進(jìn)行免疫磁珠分選后CD44+細(xì)胞百分比提高至99.9%，提示免疫磁珠分選純化后富集到了CD44+的胃癌干樣細(xì)胞。為了證實CD44+細(xì)胞的干樣特性，本研究采用了腫瘤球形成、Transwell遷移及侵襲實驗進(jìn)行驗證。

細(xì)胞成球?qū)嶒炛?，人胃癌AGS細(xì)胞生長緩慢，不形成腫瘤球，而分選富集的CD44+細(xì)胞持續(xù)增殖，在無血清培養(yǎng)條件下具有典型的球形集落，提示CD44+細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力。

CD44是細(xì)胞表面一種重要的黏附分子，可參與細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力調(diào)節(jié)，在惡性腫瘤進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)來源于人胃癌SGC7901細(xì)胞的胃癌干細(xì)胞遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)[11]。本研究自人胃癌AGS細(xì)胞分選出的CD44+細(xì)胞也展現(xiàn)出了更強(qiáng)的遷移、侵襲能力。由此可見，人胃癌細(xì)胞CD44的表達(dá)有助于促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的惡性表型，賦予其“干樣”特性。

本研究前期結(jié)果已經(jīng)證實DADS可抑制人胃癌細(xì)胞惡性表型，但其對人胃癌干樣細(xì)胞的作用不明確，因此本研究對此進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人胃癌細(xì)胞AGS在不同質(zhì)量濃度DADS處理48 h后，其光密度比對照組顯著下降，而抑制率明顯升高，具有質(zhì)量濃度依賴性。此外，30、60 mg/L DADS均可對CD44+細(xì)胞的集落形成能力產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)，且60 mg/L組高于30 mg/L組；與對照組比較，DADS組集落較小，且集落數(shù)目也減少。最后，本研究通過流式細(xì)胞儀分析表明，經(jīng)DADS處理的細(xì)胞具有G2/M期阻滯效應(yīng)。綜上所述，DADS對胃癌干細(xì)胞具有明顯生長抑制作用。

胃癌干細(xì)胞的來源之謎還未被徹底揭曉，有研究顯示，胃腸道上皮組織處于快速自我更新狀態(tài)，高分化的組織特異細(xì)胞很難發(fā)生基因突變，而干細(xì)胞維持長久的活力更易產(chǎn)生基因突變，因此胃成體干細(xì)胞發(fā)生基因突變可能是導(dǎo)致惡變的關(guān)鍵[12]。

本研究經(jīng)免疫磁珠分選富集的CD44+細(xì)胞顯示出干細(xì)胞特性，這些細(xì)胞可能驅(qū)動胃癌的發(fā)生發(fā)展。下一步需要闡明DADS作用于胃癌干細(xì)胞的作用機(jī)制，為開發(fā)靶向胃癌干細(xì)胞提供治療策略，為DADS成為胃癌治療候選藥物提供實驗依據(jù)。