(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽市421001；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市102206；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832003；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832000)

在全球范圍內(nèi)，對(duì)人類和動(dòng)物宿主的健康具有潛在影響的病原體被頻繁地檢測(cè)到[1]。大多數(shù)導(dǎo)致人類疾病的新發(fā)的病原體都是人獸共患病原菌，人獸共患病可以從野生或者家養(yǎng)動(dòng)物傳染給人類，對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康造成了重大威脅[2-4]。新疆是中國(guó)最大畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一，與8個(gè)國(guó)家接壤，國(guó)際性貿(mào)易頻繁[5]。近些年畜牧業(yè)不斷地發(fā)展，致病菌在人群中傳播速度加快，從而動(dòng)物源人獸共患病的流行風(fēng)險(xiǎn)也隨之明顯增加。牛作為新疆地區(qū)畜牧業(yè)的主要?jiǎng)游镏?，與人們的生活生產(chǎn)密切相關(guān)，是人們重要的蛋白質(zhì)來源[6]。因此，了解規(guī)?；B(yǎng)殖牛的潛在病原菌攜帶狀況調(diào)查很有必要，對(duì)有效防治人獸共患病具有重要意義。在牧場(chǎng)的生產(chǎn)實(shí)踐中，傳統(tǒng)細(xì)菌病原的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)量有限，難以滿足需求[7]。宏基因組是特定生物環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和[8]。宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)直接獲取樣本中所有核酸片段的序列信息，與特定的數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)合生物信息分析，檢測(cè)出所有微生物的種類及序列數(shù)量[9]，目前已成為國(guó)際微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，成為開發(fā)新的生物活性物質(zhì)、研究群落中微生物多樣性的新途徑,而且宏基因組學(xué)技術(shù)自動(dòng)化程度高，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物[10]。本研究基于二代宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)新疆規(guī)模化養(yǎng)殖牧場(chǎng)牛群的鼻咽和肛拭子樣品中細(xì)菌種類進(jìn)行分析鑒定，探討牛攜帶潛在病原以及人獸共患病主要菌種狀況，較系統(tǒng)地評(píng)價(jià)潛在病原菌對(duì)宿主自身和人類健康的影響，為相關(guān)疾病的防控提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2019年8月從新疆南疆和北疆集中大牧場(chǎng)的牛群中采集牛鼻咽拭子303份和肛拭子306份，其中南疆喀什市采集牛鼻咽拭子和牛肛拭子各104份，北疆石河子市采集牛鼻咽拭子199份和牛肛拭子202份。采集過程中均使用一次性用具以避免樣品交叉污染，所有的樣品經(jīng)無菌容器密封好后放入車載冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，樣品保存在-70 ℃超低溫冰箱。

1.2 宏基因組DNA的提取及BGISEQ測(cè)序

將待測(cè)樣品完全解凍后，采用QIAamp DNA micro Kit提取基因組DNA。檢測(cè)DNA純度和降解程度后，去除不合格樣品，將合格的鼻咽拭子/肛拭子DNA樣品，分別根據(jù)樣品編號(hào)順序按質(zhì)量1∶1比例每10份混合為一組，即鼻咽拭子和肛拭子各自混合為鼻咽拭子組和肛拭子組，不交叉混合。對(duì)混合后的DNA樣品進(jìn)行超聲片段化后，依據(jù)BGISEQ進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建，宏基因組測(cè)序由華大基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于原始測(cè)序數(shù)據(jù)采用Trimmomatic去除低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)；使用Kraken2以及配套的Minikrakenv2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類；基于物種豐度信息表，對(duì)不同類別樣品以及不同地區(qū)的樣本分別應(yīng)用R語言進(jìn)行基于Bray、Euclidean距離的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)、相似性分析(analysis of similarities,Anosim)和多元方差分析(Adonis)。應(yīng)用Python進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析潛在人畜共患病原菌的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

BGISEQ測(cè)序原始數(shù)據(jù)通過質(zhì)控排除一定比例低質(zhì)量數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。對(duì)于一條序列，每10個(gè)堿基為一個(gè)窗口計(jì)算堿基平均測(cè)序質(zhì)量，如果低于20，則在該窗口處切斷，并且只保留雙端都大于121 bp的reads。經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控所得29組肛拭子樣品和22組鼻咽拭子樣品的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2 微生物群落組成

根據(jù)宏基因組序列分析，共得到4個(gè)界40個(gè)門81個(gè)綱175個(gè)目398個(gè)科1 283個(gè)屬和4 218個(gè)種。在界分類水平上，所有樣品中相對(duì)豐度最大的均為細(xì)菌。其中，29組肛拭子樣品相對(duì)豐度為86.90%～98.42%；22組鼻咽拭子樣品相對(duì)豐度為74.51%～92.91%。這說明新疆牧場(chǎng)牛鼻咽部和大腸直腸部位的微生物群落組成主要是細(xì)菌。

2.3 不同樣品的細(xì)菌種類分析

2.3.1 不同類別牛樣品的細(xì)菌種類注釋分析 基于物種注釋結(jié)果，只保留在至少1個(gè)樣本中豐度大于0.01%的菌種，分析牛樣品在門和屬水平上相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌種類(圖1)。由圖1可知，在門分類水平上，肛拭子和鼻咽拭子樣品中細(xì)菌物種占主導(dǎo)地位的門為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。在屬分類水平上,肛拭子樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、異壁放線菌菌屬(Actinoalloteichus)、埃希氏菌屬(Escherichia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)；而鼻咽拭子樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為異壁放線菌菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)。

圖1 不同類別牛樣品中細(xì)菌種類排名前10位的物種豐度柱狀圖

2.3.2 不同類別牛樣品細(xì)菌群落的比較 通過PCoA分析不同樣品細(xì)菌菌群的β多樣性(圖2)。基于不同樣品類別，在門水平上，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)對(duì)所有樣品差異的貢獻(xiàn)率分別為87.32%和11.94%，累積貢獻(xiàn)率為99.26%(圖2A)；在屬水平上，PC1和PC2對(duì)所有樣品差異的貢獻(xiàn)率分別為66.85%和19.47%，累積貢獻(xiàn)率為86.32%(圖2B)。無論在門水平還是屬水平，兩組樣品在PCoA圖上均能獨(dú)自聚類，但有少部分重疊?；诓煌貐^(qū)分布，喀什市和石河子市的肛拭子樣品組出現(xiàn)交疊現(xiàn)象(圖2C)，而基于屬分類水平兩者發(fā)生了明顯的彼此分離現(xiàn)象，表現(xiàn)為獨(dú)立的分布(圖2D)。在不同分級(jí)(門和屬)水平上(圖2E和2F)，石河子市鼻咽拭子樣品基本處于中心點(diǎn)左側(cè)，而喀什市鼻咽拭子樣品組在中心點(diǎn)的左側(cè)和右側(cè)都有分布。

圖2 不同類別牛樣品細(xì)菌物種的PCoA分析A、C和E為門分類水平計(jì)算Euclidean距離；B、D和F為屬分類水平計(jì)算Bray距離。

在微生物分析中，進(jìn)行完P(guān)CoA分析后，采用Anosim分析和Adonis分析不同類別牛樣品的細(xì)菌種類差異，分別在門水平和屬水平兩個(gè)層級(jí)上進(jìn)行比較分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表1)，且組間差異大于組內(nèi)(R趨向于1；表1)。

表1 不同類別牛樣品的ANOSIM分析和Adonis分析

利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析所有牛樣品的細(xì)菌差異種類，在門水平上差異有顯著性的菌門共3種，分別是放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。在屬水平上差異有顯著性的菌屬共16種(圖3)。

圖3 不同牛樣品細(xì)菌群落差異分析a為P<0.05，b為P<0.01，與鼻咽拭子組比較。

2.4 牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類

2.4.1 不同類別牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的比較 牛樣品共檢出9種人獸共患病原菌(圖4)，分別是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pluranimalium)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、化膿性鏈球菌(Trueperella pyogenes)和多殺巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)。其中，豬鏈球菌、空腸彎曲桿菌和化膿性鏈球菌只在肛拭子樣品中檢出，鮑曼不動(dòng)桿菌只在鼻咽拭子中檢出。不同類別牛樣品中共檢出的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和肺炎鏈球菌差異存在顯著性(P<0.01)，而肺炎克雷伯氏菌和多殺巴斯德桿菌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 不同類別牛樣品潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)a為P<0.01，與鼻咽拭子組比較。

2.4.2 不同地區(qū)牛樣品中潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的比較 Wilcoxon秩檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喀什市肛拭子樣品中的大腸桿菌和肺炎鏈球菌相對(duì)豐度極顯著高于石河子市(P<0.01)；喀什市肛拭子樣品中的蠟樣芽孢桿菌和豬鏈球菌相對(duì)豐度顯著高于石河子市(P<0.05)。兩個(gè)地區(qū)鼻咽拭子樣品中共檢出的蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖5)。

圖5 不同地區(qū)潛在人獸共患病細(xì)菌病原菌種類的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)a為P<0.05，b為P<0.01，與石河子市組比較。

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外研究大多都是基于16S高通量測(cè)序?qū)εＨ榉垦滓约芭Ａ鑫?牛鼻咽微生物區(qū)系的報(bào)道[11-13]，而關(guān)于牛攜帶潛在人獸共患病原菌及細(xì)菌菌群多樣性全面鑒定分析的研究尚未有報(bào)道。不同的檢測(cè)方法和樣本對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的分析各有不同，但利用先進(jìn)的二代高通量測(cè)序可對(duì)樣本中全部的微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)等進(jìn)行全面分析，進(jìn)而可以最大限度地挖掘微生物資源，也可以進(jìn)行傳染病病原溯源和潛在病原快速高通量調(diào)查[14]。

本研究應(yīng)用宏基因組二代測(cè)序技術(shù)，以牛鼻咽拭子和肛拭子樣品提取DNA對(duì)新疆南疆和北疆規(guī)?；B(yǎng)殖牧場(chǎng)牛潛在病原菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查分析，通過對(duì)牛樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)牛腸道和牛呼吸道中微生物主要菌門均以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門4種為優(yōu)勢(shì)菌門。既往國(guó)內(nèi)外研究不同品系的牛瘤胃微生物結(jié)果顯示主要菌種均是擬桿菌和厚壁菌[12,15]，而本研究牛腸道以放線菌門和變形菌門占主導(dǎo)，厚壁菌和擬桿菌次之，這一差異可能是因?yàn)榕５纳畹赜蚝铜h(huán)境，又或是喂養(yǎng)飼料的不同造成其腸道細(xì)菌菌門結(jié)構(gòu)的不同。本研究牛呼吸道中優(yōu)勢(shì)菌門與Zeineldin等[13]結(jié)果一致，但優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同，這可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖環(huán)境不同，導(dǎo)致上呼吸道不斷暴露于周圍環(huán)境中的多種細(xì)菌中[16]。在物種相對(duì)豐度的基礎(chǔ)上，本研究也進(jìn)行了相似性和差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛呼吸道和腸道細(xì)菌菌群有一定的相似性，但差異存在顯著性(P<0.05)，并且組間差異大于組內(nèi)差異。本研究表明，新疆規(guī)?；B(yǎng)殖牧場(chǎng)牛攜帶的細(xì)菌群落相對(duì)豐富，且不同樣品組間存在差異。

另外，本研究對(duì)新疆南疆喀什市和北疆石河子市兩個(gè)地區(qū)的細(xì)菌菌系作比較分析，兩地區(qū)的牛肛拭子樣品在門水平上均表現(xiàn)出豐富細(xì)菌菌群，但隨著分級(jí)水平的降低，養(yǎng)殖場(chǎng)的細(xì)菌組成差別不斷增加，在屬水平上兩地區(qū)各類細(xì)菌在數(shù)量及分布上有顯著差異；兩地區(qū)鼻咽拭子樣品組在門和屬水平上均反映出養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。差異性分析結(jié)果表明兩個(gè)地區(qū)的牛肛拭子樣品和牛鼻咽拭子樣品均是組間差異大于組內(nèi)(P<0.05)。究其兩地區(qū)呈現(xiàn)出差異的原因，可能與宿主攜帶的微生物群落結(jié)構(gòu)與其遺傳背景、生長(zhǎng)環(huán)境、生活飲食和免疫狀況等眾多因素有關(guān)[17]。

本次測(cè)序，除檢測(cè)到大量常規(guī)菌外，還從樣品中檢出了人獸共患病致病菌。本研究在牛樣品中鑒定發(fā)現(xiàn)有9種人獸共患病原菌，其中大部分都是食源性細(xì)菌性致病菌[18-20]，雖然目前這些菌種在動(dòng)物的感染報(bào)道較少，但是在某些飼養(yǎng)條件不利因素誘發(fā)下，這些條件致病菌可能大量繁殖，導(dǎo)致宿主發(fā)病，所以其可能成為人獸共患病傳染病的潛在病原，應(yīng)引起高度重視。還有值得注意的是，不管基于樣品類型還是地區(qū)水平，蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌均有分布。蠟樣芽孢桿菌被認(rèn)為是一種常見的食品污染物，可以引起人和動(dòng)物產(chǎn)生嘔吐和腹瀉等臨床癥狀[21]。肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性人獸共患病機(jī)會(huì)致病菌，其是一種新興的動(dòng)物鏈球菌，與牛和禽類原發(fā)感染相關(guān)[22]。牛源細(xì)菌性人獸共患病致病菌不僅影響牛自身的安全，還可能對(duì)牧民以及通過牛源食品對(duì)大眾的健康產(chǎn)生威脅，因此對(duì)這類疫病的防控也尤為重要。

綜上，本研究對(duì)新疆地區(qū)牧場(chǎng)牛潛在病原菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查，總結(jié)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和牛源人獸共患病致病菌的菌種，并分別比較分析了不同樣品和不同地區(qū)牛攜帶菌群的差異性。在后續(xù)研究中，可以比對(duì)不同的數(shù)據(jù)庫挖掘更多的數(shù)據(jù)，分析病毒的分布情況；結(jié)合牧民的流行病學(xué)資料和人獸共患病致病菌的疾病特征作綜合分析，評(píng)價(jià)傳播和感染的風(fēng)險(xiǎn)，旨在為牛的規(guī)?；B(yǎng)殖和牛源食品的安全等提供更多的科學(xué)支持。