(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽市 421001)

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2015年中國肝癌發(fā)病人數(shù)為37.0萬人，發(fā)病率為26.92/10萬，死亡人數(shù)32.6萬，死亡率23.72/10萬[1]。原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，病程短，發(fā)展迅速，當(dāng)前主要治療手段有手術(shù)切除、放射治療、藥物治療、肝移植等。但肝癌易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，且對放化療具有抵抗性，尋求治療肝癌的藥物具有重要意義。

原發(fā)性肝癌中最常見的肝癌組織類型是肝細(xì)胞癌[2]。本文探討了NU7026抑制DNA-PKcs對肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力的影響，為治療肝癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞(HepG2)由軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院周平坤研究員惠贈(zèng)。HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NU7026(LY293646，C17H15NO3)購于MCE公司，純度為99.95%。細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 CCK8實(shí)驗(yàn)

取處于指數(shù)生長期的 HepG2 細(xì)胞，用含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液接種于 96 孔板中，加入適量的細(xì)胞懸液(約7 000～8 000個(gè)/孔)，待細(xì)胞貼壁后，分別用5、10、15、20 μmol/L NU7026進(jìn)行處理，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，孵育1 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定 450 nm 波長處的光密度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(空白組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.3 生長曲線實(shí)驗(yàn)

按2×104個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10 μmol/L NU7026處理細(xì)胞每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每隔24 h計(jì)數(shù)1次，連續(xù)計(jì)數(shù)3天，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。

1.4 克隆實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，10 μmol/L NU7026處理細(xì)胞，10天后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入固定液3 mL，固定30 min；再加入3 mL Giemsa染色30 min，最后用流水緩慢沖洗，晾干。計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)，克隆形成率(%)=克隆數(shù)/[實(shí)驗(yàn)組接種細(xì)胞數(shù)×(對照組克隆數(shù)/對照組接種細(xì)胞數(shù))]×100%。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后用200 μL無菌的槍頭尖端在每孔相同位置做線性劃痕，再用PBS輕輕沖洗2～3遍，10 μmol/L NU7026處理細(xì)胞，分別在0、24、48、72 h后于顯微鏡下拍照觀察劃痕，采用Image J 軟件觀察計(jì)算細(xì)胞劃痕面積，面積愈合率(%)=(0 h劃痕面積-培養(yǎng)后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期試驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10 μmol/L NU7026處理細(xì)胞，按照說明書步驟進(jìn)行，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。取適量HepG2細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用10 μmol/L NU7026處理0、4、8、12、24 h后收樣。按照說明書步驟進(jìn)行，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NU7026對HepG2細(xì)胞活性的影響

隨著NU7026濃度的增加，HepG2細(xì)胞存活率下降。與0 μmol/L組和DMSO組比較，15 μmol/L和20 μmol/L NU7026作用HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降(P<0.05；圖1)；10 μmol/L NU7026作用HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，與DMSO組細(xì)胞存活率比較，差異有顯著性(P<0.05)，與0 μmol/L 組細(xì)胞存活率比較，差異無顯著性(P>0.05)；查閱文獻(xiàn)[3]及根據(jù)前期研究[4]，本研究中10 μmol/L NU7026對HepG2細(xì)胞沒有明顯的毒性作用，故選擇10 μmol/L NU7026進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為空白組、對照組(0.1%DMSO)和NU7026組(10 μmol/L NU7026)。

圖1 CCK8檢測不同濃度NU7026對HepG2細(xì)胞活性的影響a為P<0.05，與0 μmol/L組比較；b為P<0.05，與DMSO組比較。

2.2 各組HepG2細(xì)胞增殖能力比較

NU7026作用HepG2細(xì)胞72 h 后，NU7026組細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(P<0.05；圖2)；NU7026組細(xì)胞克隆數(shù)少于對照組，克隆形成率明顯降低(P<0.05；圖2)。

圖2 各組HepG2細(xì)胞增殖能力的比較A為培養(yǎng)10天后克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分布圖(Giemsa染色)和柱狀圖；B為細(xì)胞生長曲線圖。 a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

2.3 各組HepG2細(xì)胞遷移能力

NU7026作用細(xì)胞24 h后，與對照組相比，面積愈合率無明顯差異(P>0.05)；NU7026作用細(xì)胞48 h后，劃痕面積比對照組稍大，面積愈合率無明顯差異(P>0.05)；但在作用72 h后，NU7026組劃痕面積大于對照組，面積愈合率明顯降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組HepG2細(xì)胞遷移能力比較A為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移(200×)；B為細(xì)胞劃痕愈合率折線圖。a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

2.4 各組HepG2細(xì)胞的凋亡與周期

NU7026作用HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05；圖4)。隨著NU7026作用時(shí)間增加，HepG2細(xì)胞凋亡率逐漸增加。NU7026作用HepG2細(xì)胞12 h后，出現(xiàn)了輕微的G2/M阻滯現(xiàn)象，但細(xì)胞周期未出現(xiàn)明顯改變(圖5)。

圖4 各組HepG2細(xì)胞凋亡比較A為細(xì)胞凋亡圖；B為細(xì)胞凋亡率柱狀圖。a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

圖5 各組HepG2細(xì)胞周期的比較A為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期圖；B為細(xì)胞周期占比圖。

3 討 論

肝癌在全球惡性腫瘤發(fā)病譜中排第六，其中中國肝癌新發(fā)病例數(shù)將近占全球發(fā)病的一半[5]。DNA-PKcs是一種相對分子質(zhì)量約為470 kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥基因(Ataxia telangiectasia mutated，ATM)、RAD3相關(guān)蛋白(Ataxia telangiectasiaand Rad3-related protein，ATR)同屬于磷酸酰肌醇3-激酶相關(guān)蛋白激酶(PIKK)家族。DNA-PKcs和ATM在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中起著重要的作用，ATR主要參與DNA單鏈斷裂修復(fù)。DNA-PKcs不僅參與淋巴細(xì)胞的V(D)J重組和類別轉(zhuǎn)換重組，保護(hù)染色體末端，而且DNA-PKcs響應(yīng)胰島素信號傳導(dǎo)，促進(jìn)肝臟中碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸[6-7]。

DNA-PKcs抑制劑有渥曼青霉素、NU7441、NU7026、IC化合物等。NU7026對DNA-PKcs抑制性特異度高，能有效抑制DNA-PKcs Ser2056磷酸化[4]。本研究通過生長曲線實(shí)驗(yàn)和克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，表明NU7026抑制DNA-PKcs將降低HepG2細(xì)胞增殖能力，與其他研究結(jié)果相一致。用siRNA介導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞中DNA-PKcs沉默，細(xì)胞增殖速度減慢，且高表達(dá)DNA-PKcs可通過AKT/GSK3/c-myc信號通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖[8]。同樣用siDNA-PKcs轉(zhuǎn)染肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu后，細(xì)胞增殖能力降低，可能抑制DNA-PKcs后胸腺嘧啶合成酶(TS)表達(dá)下降，從而抑制DNA合成，細(xì)胞增殖生長變慢[9]。但也有研究表明NU7441抑制DNA-PKcs促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞中SSEA4+間充質(zhì)祖細(xì)胞增殖[10]。沉默DNA-PKcs不僅抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖，而且也抑制細(xì)胞遷移和侵襲[11]。

本文結(jié)果顯示抑制DNA-PKcs能降低HepG2細(xì)胞遷移能力。有研究表明將沉默DNA-PKcs的HepG2細(xì)胞移植到裸鼠中，其腫瘤生成率明顯降低[8]。DNA-PKcs通過RhoA/ROCk2通路調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和磷酸化肌球蛋白輕鏈 2表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)外骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)ITGA5和SDC4基因與DNA-PKcs可能對細(xì)胞遷移侵襲運(yùn)動(dòng)具有互相調(diào)節(jié)作用[13]。

本研究用NU7026抑制DNA-PKcs 24、48、72 h，HepG2細(xì)胞凋亡增加，與其他研究結(jié)果一致。有研究表明沉默DNA-PKcs后，通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu凋亡[14]。也有研究表明沉默DNA-PKcs后，有絲分裂細(xì)胞紡錘體異常，胞質(zhì)分裂失敗，有絲分裂延長等，最終導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂災(zāi)變而凋亡[15]。

用TDR將HeLa細(xì)胞同步化至G1期后釋放，沉默DNA-PKcs的HeLa細(xì)胞在6 h出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，表明抑制DNA-PKcs會引起G2/M期阻滯[16]。用nocodazole同步化細(xì)胞后釋放，抑制HeLa細(xì)胞DNA-PKcs，H3-pS10陽性細(xì)胞增加，表明細(xì)胞阻滯在有絲分裂期[17]。也有研究表明沉默MG-63細(xì)胞DNA-PKcs 48 h，細(xì)胞周期無明顯改變[11]。在本研究中NU7026抑制DNA-PKcs對HepG2細(xì)胞周期無明顯改變，可能是因?yàn)榧?xì)胞DNA損傷不嚴(yán)重，DNA修復(fù)時(shí)間較短，細(xì)胞能較快地通過周期檢查點(diǎn)，故未出現(xiàn)明顯G2/M期阻滯。

綜上所述，NU7026能抑制HepG2細(xì)胞增殖能力和遷移能力，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。