(1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省衡陽(yáng)市 421001；2.南岳生物制藥有限公司，湖南省衡陽(yáng)市 421007；3.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市 421001)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一種性傳播疾病，嚴(yán)重危害成人與新生兒身心健康并可增加艾滋病感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)[1]。盡管青霉素可以有效地治療梅毒，但梅毒發(fā)病人數(shù)在中國(guó)仍呈不斷上升趨勢(shì)[2]。疫苗是防控梅毒經(jīng)濟(jì)有效的措施，然而至今未獲成功[3]。

Tp雖缺乏內(nèi)毒素，也不產(chǎn)生明顯外毒素，但具有突破神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤屏障的強(qiáng)大侵襲力[4]，這與其表面黏附素密切相關(guān)[4-5]。黏附素不但可以介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞和(或)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)如纖連蛋白、層粘連蛋白、纖維蛋白原等[6-8]的黏附，有些黏附素(如Tp0751)還具有裂解ECM的金屬激酶活性[9]，導(dǎo)致Tp通過循環(huán)系統(tǒng)或組織間隙播散。黏附素位于Tp表層，直接接觸免疫系統(tǒng)，因此抗黏附成為研發(fā)梅毒疫苗的中心環(huán)節(jié)[3-4]。Tp0751、Tp0136和Tp0435是目前發(fā)現(xiàn)的重要Tp黏附素，三者在新西蘭兔模型中的免疫保護(hù)性已有研究報(bào)道，但Tp0751的細(xì)胞定位和保護(hù)性具有明顯爭(zhēng)議[6,10-11]；Tp0136全蛋白具有部分免疫保護(hù)性[8]，但其氨基端(N端)保守區(qū)能否誘導(dǎo)免疫保護(hù)未見報(bào)道；Tp0435在新西蘭兔體內(nèi)未誘生出保護(hù)性[12]。新西蘭兔是公認(rèn)的梅毒疫苗模型，但目前仍缺乏公認(rèn)的檢測(cè)兔細(xì)胞因子的免疫試劑[13]，Lu等[14]觀察到Tp能在C57BL/6小鼠體內(nèi)增殖和播散的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為應(yīng)用新的梅毒疫苗動(dòng)物模型提供了依據(jù)。

本研究嘗試以C57BL/6小鼠為動(dòng)物模型，觀察各黏附素免疫誘導(dǎo)小鼠的特異性體液免疫和細(xì)胞應(yīng)答水平、Tp攻擊后在免疫小鼠體內(nèi)播散情況，為篩選梅毒疫苗侯選分子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、被轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-30a-Tp0136N(Tp0136氨基端保守區(qū)，即第32～234位氨基酸)或pET-30a-Tp0435(Tp0435去信號(hào)肽后全長(zhǎng)蛋白，即第23～156位氨基酸)的E.coli JM109重組表達(dá)菌、被轉(zhuǎn)化pET-30a-Tp0751(Tp0751去信號(hào)肽后全長(zhǎng)蛋白，即第24～237位氨基酸)的E.coli BL21表達(dá)菌為南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存[15]。QIAamp DNA Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Talent熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，Leuko Act Cktl With GolgiPlug、Cytofix/Cytoperm Soln Kit、Mouse BD Fc BlockTM、PE抗鼠CD4抗體、FITC抗鼠CD8a抗體、PerCPCy5.5抗鼠IL-4抗體、APC抗鼠IFN-γ抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。C57BL/6小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。定量PCR儀(LightCycler96)購(gòu)自美國(guó)Roche公司，流式細(xì)胞儀FACSCalibur購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

以異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-Tp0136N、pET-30a-Tp0435在E.coli JM109中表達(dá)；pET-30a-Tp0751在E.coli BL21中表達(dá)；SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，鎳柱純化表達(dá)產(chǎn)物，純化蛋白分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組蛋白免疫動(dòng)物及血清采集

將5～6周齡的雄性C57BL/6小鼠40只隨機(jī)分為4組(PBS對(duì)照組、rTp0751組、rTp0136N組、rTp0435組)，每組10只。將蛋白與等體積弗氏佐劑混勻，以2周為間隔，按0、2、4周時(shí)間點(diǎn)分3次皮下注射，重組蛋白免疫劑量為每只30 μg/次。每次免疫前及末次免疫2周后采集小鼠尾靜脈血，分離血清，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA檢測(cè)免疫血清特異性IgG抗體

分別以100 μL純化rTp0751、rTp0136N及rTp0435(10 mg/L)包被96孔酶標(biāo)板，以上述制備的各待測(cè)免疫鼠血清(1∶100稀釋)(同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照)為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)為二抗，四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞內(nèi)IFN-γ與IL-4

無菌取末次免疫2周后小鼠脾細(xì)胞(每組5只)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/μL，按試劑盒使用說明用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞內(nèi)干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)與白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)含量。

1.6 Tp攻擊感染與qPCR檢測(cè)小鼠各組織中Tp載量

末次免疫后第3周，取來自新西蘭兔睪丸的新鮮Tp，對(duì)各組小鼠(每組5只)皮下、直腸、陰莖海綿體3個(gè)部位攻擊感染，每只小鼠攻擊Tp總數(shù)為3×106個(gè)。攻擊后6周，取小鼠心、脾、腦組織，QIAamp DNA Mini Kit提取各組織DNA。根據(jù)文獻(xiàn)[10,16]合成Tp內(nèi)鞭毛flaA與鼠β-actin基因引物，引物序列如下：flaA上游引物5′-AACGCAAACGCAATGATA AA-3′，下游引物5′-CCAGGAGTCGAACAGGAGAT AC-3′；β-actin上游引物5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物5′-GCCGGACTCATCGTACT CC。按照SYBR green試劑盒說明，在20 μL反應(yīng)體積(含2 μL DNA樣本，10 μL 2×mix,1.2 μL的0.03 mmol/L正向和反向引物，6.8 μL雙蒸水)中進(jìn)行定量PCR。所有檢測(cè)在LightCycle 96儀器上進(jìn)行。擴(kuò)增flaA和β-actin的qPCR條件如下：預(yù)變性，95 ℃孵育15 min；隨后40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s。熔解曲線分析1個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。線性質(zhì)粒DNA從107～10拷貝數(shù)的連續(xù)10倍稀釋，小鼠gDNA從150～1.17 mg/L的連續(xù)2倍稀釋，分別構(gòu)建flaA和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組標(biāo)本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值，應(yīng)用T-Test檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原核重組蛋白表達(dá)分析

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-30a-Tp0751、pET-30a-Tp0136N與pET-30a-Tp0435經(jīng)誘導(dǎo)分別表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為26 kDa(可溶性)、23 kDa(包涵體形式)與17 kDa(可溶性)大小的重組蛋白(圖1)。

圖1 各重組蛋白的SDS-PAGEM為Maker；1、7和8為全菌蛋白，其他為純化蛋白。

2.2 血清特異性IgG抗體水平

各免疫組小鼠血清特異性IgG水平隨免疫時(shí)間增加而逐漸升高，并于末次免疫后2周(即初次免疫后第6周)達(dá)到峰值，且均高于PBS對(duì)照組(P<0.01；圖2)。

圖2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清特異性IgG水平a為P<0.05，與PBS對(duì)照組比較。

2.3 免疫小鼠脾細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-4水平含量

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示各免疫組CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+含量均高于PBS對(duì)照組(P<0.01；圖3)。各組小鼠可檢測(cè)到的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4水平均極低(圖3)。

圖3 各組小鼠脾細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ及IL-4水平a為P<0.01，與PBS對(duì)照組比較。

2.4 攻擊后各組小鼠不同組織內(nèi)Tp載量

qPCR檢測(cè)Tp攻擊感染后小鼠不同組織Tp-DNA載量顯示，在脾臟、心臟與腦組織中，rTp0751、rTp0136N組Tp載量明顯低于PBS對(duì)照組(P<0.05)，rTp0435組與PBS對(duì)照組差異無顯著性(圖4)。

圖4 Tp攻擊后各組小鼠不同組織內(nèi)Tp載量a為P<0.05，與PBS對(duì)照組比較。

3 討 論

Tp不可體外人工培養(yǎng)和基因操作，外膜蛋白稀少，缺乏內(nèi)毒素(脂多糖)和常見毒力因子，缺乏理想的疫苗動(dòng)物模型是梅毒疫苗研究進(jìn)展緩慢的主要限制因素[3-4,13]。Tp強(qiáng)大侵襲力這一特點(diǎn)使得抗黏附作用一直成為梅毒疫苗研究的焦點(diǎn)。一方面，抗黏附素抗體不但能阻止Tp對(duì)宿主細(xì)胞或ECM的黏附，使其失去組織定植能力而終止早期感染及播散，而且可調(diào)理巨噬細(xì)胞吞噬[17]；另一方面，黏附素誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，即通過黏附素特異性活化的CD4+Th1細(xì)胞、CD8+CTL等產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞，加強(qiáng)其吞噬殺傷Tp的活性，被認(rèn)為是Tp早期感染后清除的主要機(jī)制[18]。因此，理想的梅毒疫苗應(yīng)能同時(shí)誘生適應(yīng)性體液免疫和細(xì)胞免疫的混合型免疫應(yīng)答，以此共同清除Tp[3-4,13]。本研究顯示，與PBS對(duì)照組比較，各重組蛋白免疫組小鼠的血清特異性IgG水平隨免疫次數(shù)的增加逐漸升高，并于末次免疫后2周達(dá)到峰值，表明重組蛋白Tp0751、Tp0136N、Tp0435具有良好的免疫原性。小鼠末次免疫后2周，與PBS對(duì)照組相比，3種重組蛋白的免疫鼠脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均能產(chǎn)生了大量的IFN-γ，提示3種重組蛋白均可有效激發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。以上黏附素誘生的高水平的適應(yīng)性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答為獲得保護(hù)性免疫提供了基礎(chǔ)。

既往評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)Tp載量常用暗視野顯微鏡或鍍銀染色后鏡檢觀察，此類方法靈敏度較低，主觀因素影響大。qPCR檢測(cè)動(dòng)物感染后遠(yuǎn)端靶組織中Tp-DNA載量，具有靈敏、客觀、定量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是梅毒疫苗方法學(xué)的一個(gè)重大進(jìn)步[19]。本研究檢測(cè)Tp攻擊6周后小鼠脾臟、心臟、腦組織中Tp的DNA載量，發(fā)現(xiàn)Tp0751、Tp0136N小鼠免疫組的各組織中Tp載量均明顯低于PBS對(duì)照組，而Tp0435免疫組與對(duì)照組無明顯差異，表明Tp0751、Tp0136N免疫后能有效阻止Tp在小鼠體內(nèi)播散。有關(guān)Tp0751在Tp的細(xì)胞定位和在新西蘭兔模型中是否能誘導(dǎo)免疫保護(hù)性存在分歧，Parker等[6]認(rèn)為Tp0751為Tp表層的黏附素并具有金屬激酶活性，隨后Lithgow等[10]觀察到其免疫新西蘭兔后宿主器官的Tp負(fù)荷明顯減低；Luthra等[11]則認(rèn)為Tp0751位于Tp的胞質(zhì)，不能誘導(dǎo)調(diào)理素抗體產(chǎn)生，也不能在新西蘭兔體內(nèi)誘導(dǎo)免疫保護(hù)性。本研究結(jié)果支持Lithgow等[10]的結(jié)論，即Tp0751免疫后能延緩Tp在動(dòng)物體內(nèi)的播散，但具體免疫保護(hù)機(jī)制有待深入研究。Tp0136在Tp株間具有高度異質(zhì)性[7]，不適合以全蛋白作為疫苗分子，但其在氨基端(N端)存在一個(gè)能結(jié)合細(xì)胞纖連蛋白和血漿纖連蛋白的高度保守區(qū)，本研究中以該保守區(qū)免疫能誘導(dǎo)高水平抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫后明顯延緩Tp在小鼠體內(nèi)播散，這與前期報(bào)道Tp0136全長(zhǎng)蛋白免疫后可延緩Tp攻擊后新西蘭兔皮損潰瘍形成[7]具有一致性，表明該保守區(qū)可能為梅毒疫苗的重要候選分子。本研究中Tp0435免疫小鼠的遠(yuǎn)端組織Tp載量未明顯減低，這與Parveen等[12]報(bào)道的Tp0435免疫兔的Tp攻擊部位皮損直徑和Tp載量未明顯減低結(jié)果有一致性，再次證實(shí)了Tp0435盡管免疫原性強(qiáng)但不適宜作為候選疫苗分子。Tp0435屬于強(qiáng)免疫原性的脂蛋白，最近發(fā)現(xiàn)其除了存在于Tp內(nèi)膜，還可表達(dá)于Tp細(xì)胞表面，其未能誘導(dǎo)免疫保護(hù)性可能是Tp膜表面的Tp0435表達(dá)隨機(jī)且有限，導(dǎo)致相應(yīng)抗體不能有效調(diào)理吞噬細(xì)胞吞噬Tp的調(diào)理作用[12]，同時(shí)也提示抗體在阻止Tp播散中具有重要作用，單獨(dú)的細(xì)胞免疫不足以阻斷Tp播散。

長(zhǎng)期以來新西蘭兔被公認(rèn)為Tp感染和疫苗研究的動(dòng)物模型，但存在諸多不足，如缺乏公認(rèn)的用于ELISA或流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)的兔細(xì)胞因子和兔淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志分子(如CD4、CD8)的單克隆抗體的免疫檢測(cè)試劑[13]，難以評(píng)價(jià)免疫兔體內(nèi)的細(xì)胞應(yīng)答水平，且建立新西蘭兔模型成本高。Tp感染鼠除不能觀察到類似人類一期梅毒硬下疳的皮膚潰瘍外，其他病程進(jìn)展與新西蘭兔相似[16]，而且目前小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)試劑豐富成熟，構(gòu)建小鼠模型成本低，可作為新西蘭兔動(dòng)物模型的補(bǔ)充用于研究抗原免疫原性和觀察Tp體內(nèi)播散[14]。

綜上所述，本研究以C57BL/6小鼠為免疫和感染攻擊模型，觀察到Tp0751、Tp0136N與Tp0435能誘導(dǎo)小鼠高水平的細(xì)胞免疫與體液免疫應(yīng)答，Tp0751與Tp0136N免疫小鼠后能有效阻止Tp向遠(yuǎn)端靶組織播散，具有部分免疫保護(hù)性，可望作為梅毒疫苗候選分子。