李亞楠，范雨佳，孫 欣，祁小飛，姚勇利，魯 燕

（1.青海省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，青海 西寧 810007；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 蘇州 215006；3.蘇州工業(yè)園區(qū)星湖醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 蘇州 215126；4.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，江蘇 蘇州 215006）

在人體胃腸道中大約有100萬億 個微生物，其數(shù)量比人類細胞的數(shù)量高出10倍[1]。腸道菌群被稱為人體“隱藏的器官”，涉及多種生理功能，如：促進食物消化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、抵抗病原體、產(chǎn)生能量、免疫調(diào)節(jié)等，進而參與人體健康的維持[2]。腸道菌群受基因、分娩方式、年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）、生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活方式、抗生素等多種因素的影響，其中基因和飲食因素起著重要的作用。腸道菌群在不同國家人群中存在差異，如歐美人群擬桿菌屬含量最多[3]，韓國人群硒糞桿菌屬含量最多[4]，蒙古人群普氏菌屬含量最多[5]。我國不同民族人群腸道菌群亦存在差異，如黎族人群腸道中鏈型桿菌屬、普氏菌屬、巨型球菌屬相對豐度高于其他民族人群[6]；維吾爾族人群腸道中乳酸桿菌屬相對豐度高于漢族，而其他菌屬均低于漢族人群[7]。目前歐美國家進行人群與腸道菌群的研究較多，我國較少，對于高海拔地區(qū)不同民族人群腸道菌群差異的研究更是鮮有報道。因此，本研究擬探索高海拔地區(qū)藏、漢兩民族腸道菌群的差異并分析導(dǎo)致這種差異的影響因素，為中國人群腸道菌群的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取青海省海南州共和縣非疾病藏族人與漢族人各100 名作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18 歲以上；(2)本院體檢結(jié)果正常，無急慢性疾病及傳染病史；(3)BMI 18.5～22.9 kg/m2；(4)近1個月內(nèi)無服用抗生素藥物史；(5)無益生菌補充史。研究對象知曉研究目的及流程并簽署知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集：非疾病藏族人與漢族人各100 名，2組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對藏、漢兩組研究對象進行背景資料及日常飲食的種類及攝入量的問卷調(diào)查。

1.2.2 實驗室檢查：研究對象采集空腹血，檢測空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma glutamine transpeptidase, GGT）、甘油三酯（triglyceride, TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol, LDL-C）、血肌酐、血尿素氮（urea nitrogen, BUN）、血尿酸（uric acid, UA）。

1.2.3 糞菌采集：從研究對象中選取藏族與漢族人群各10 名，采集糞便樣品，行16S rRNA基因高通量測序。具體操作如下：提前一天將糞便采集器交給研究對象，囑次日晨起將糞便采集盒放在馬桶上，兩端固定，將衛(wèi)生紙放在采集盒底部，2～3層，將大便解在衛(wèi)生紙的上方，用采集勺在糞便中間內(nèi)部取約花生粒大小（≥2 g）的糞便樣品，將采集勺放入裝有保存液的儲存管中，搖勻，使糞便樣品完全浸泡在保存液中，放置冰箱－80 ℃保存。漢族人群糞便樣品標(biāo)記為QHB1-10、藏族人群糞便樣品標(biāo)記為QHZ1-10。

1.2.4 DNA提取及16S rRNA基因片段PCR擴增：將DNA提取試劑盒提取的DNA作為模板，利用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增16S rRNA 基因的V3-V4可變區(qū)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計學(xué)方法：構(gòu)建稀釋性曲線；用R(3.4.1)語言對相似水平為97%的操作分類單元（operational taxonomic units, OUT）樣品繪制韋恩圖；用R(3.4.1)語言ggplot2對物種分類信息數(shù)據(jù)表繪制柱狀圖來表現(xiàn)不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)；各物種所占比例用Krona軟件顯示；用kruskal_wilcox非參數(shù)檢驗分析Alpha多樣性；主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis, PCoA）采用非加權(quán)；物種的組間差異由Metastats、LEfSe軟件進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均先行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料，以（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t法；偏態(tài)資料以中位數(shù)M(P25,P75)表示，兩兩比較采用Wilcoxon秩檢驗（Wilcoxon's rank sum test）；采用Pearson相關(guān)行相關(guān)性分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藏族與漢族人群一般資料比較 對藏、漢兩組人群的性別構(gòu)成、年齡、BMI、腰圍（WC）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、腎功、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、GGT、FBG、甲型肝炎抗體、丙型肝炎抗體及乙型肝炎抗原進行比較，兩組人群差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 藏族與漢族人群一般資料比較

2.2 藏族與漢族人群飲食結(jié)構(gòu)比較 日常飲食種類及攝入量的問卷調(diào)查結(jié)果顯示，藏族人群與漢族人群的飲食結(jié)構(gòu)存在明顯差異，藏族人群每日蛋白質(zhì)、脂肪及酒精攝入量高于漢族人群，蔬菜、水果攝入量低于漢族人群，藏族人群以雜糧（小米、青稞等）為主食，漢族人群以細糧（大米、小麥面粉）為主食。（表2）

表2 藏族與漢族人群飲食結(jié)構(gòu)差異

2.3 藏族與漢族人群腸道菌群組成比較

2.3.1 藏族與漢族人群糞便樣本測序情況：從藏、漢兩組研究對象中各隨機抽取10 名進行糞菌檢測，藏族人群10 個糞便樣本，共獲得350 288 條有效序列，進行質(zhì)控過濾后獲得301 752 條有效序列，聚類產(chǎn)生1 192 個OTU；漢族人群10 個糞便樣本，共獲得337 573 條有效序列，進行質(zhì)控過濾后獲得284 778 條有效序列，聚類產(chǎn)生1 623 個OTU。

2.3.2 藏族與漢族人群腸道菌群的稀釋性曲線：通過作稀釋性曲線，評估所采集樣品的測序深度情況，圖1示曲線逐漸平坦說明研究測序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映所采集樣品的絕大部分腸道菌群信息。

圖1 藏族與漢族人群腸道菌群的稀釋性曲線

2.3.3 藏族與漢族人群腸道菌群OTU數(shù)目組成：藏漢兩組人群共有的OTU為248 個，藏族人群獨有的OTU為23 個，漢族人群獨有的OTU為154 個。

2.3.4 藏族與漢族人群腸道菌群在門水平上的組成比較：在門水平上，藏族人群腸道菌群的優(yōu)勢物種依次為：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭菌門；漢族人群腸道菌群的優(yōu)勢物種依則次為：厚壁菌門、擬桿菌門、軟壁菌門、變形菌門、放線菌門（圖2）。

圖2 藏族與漢族人群腸道菌群在門水平上的組成比較

Krona分析顯示兩組人群擬桿菌門/厚壁菌門（B/F）比例及普氏菌在擬桿菌中的比例存在差異（表3）。

表3 藏族與漢族人群腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門的相對比例

藏、漢兩人群腸道菌群共有且豐度大于1%的6個菌屬為：擬桿菌屬、糞桿菌屬、糞球菌屬、梭菌屬、布芬特菌屬、Butyricicoccus。

2.4 藏族與漢族人群腸道菌群的組間差異分析PCoA分析應(yīng)用unweighted.unifrac方法比較兩組人群樣品間的差異，第1主成分的貢獻率為61.44%，第2主成分的貢獻率為16.04%，綠色為藏族人群，紅色為漢族人群，圖中顯示藏族人群與漢族人群有明顯的分離趨勢，左上大部分為藏族人群，左下大部分為漢族人群，說明兩組人群腸道菌群存在差異。兩組人群可見聚類傾向，藏族人群在左上聚類明顯，漢族人群在左下聚類明顯，提示同組組間具有相似性。另外圖中QHB 2也出現(xiàn)在左上方，考慮存在混雜現(xiàn)象（圖3）。

圖3 藏族與漢族人群腸道菌群PCoA分析

Matastats組間群落顯著性差異分析結(jié)果顯示，在門水平上藏族人群與漢族人群擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、軟壁菌門、放線菌門存在顯著差異，藏族人群擬桿菌門、變形菌門相對豐度高于漢族人群，厚壁菌門、軟壁菌門、放線菌門相對豐度低于漢族人群（圖4）。

圖4 藏族與漢族人群腸道菌群Matastats組間群落差異分析

LEfSe分析差異物種顯示，綠色節(jié)點表示在藏族人群中起到重要作用的菌群，紅色節(jié)點表示在漢族人群中起到重要作用的菌群，擬桿菌科、Alcaligenaceae科對藏族人群腸道菌群組成起重要作用，雙歧桿菌科、Loriobacteriaceae科、乳酸桿菌科、Leuconostocaceae科、Christensenellaceae科、瘤胃球菌科則對漢族人群腸道菌群組成起重要作用（圖5）。

圖5 藏族與漢族人群腸道菌群的LEfSe分析

藏族人群擬桿菌中普氏菌、雙歧桿菌及厚壁菌門中乳桿菌與漢族人群存在差異（圖6），其相對豐度均低于漢族人群。

圖6 藏族與漢族人群腸道菌群中普氏菌（A）、雙歧桿菌（B）、乳桿菌（C）的差異*P＜0.05

2.5 飲食結(jié)構(gòu)與菌群差異的相關(guān)性分析 腸道菌群中擬桿菌的豐度與蛋白質(zhì)的攝入量呈正相關(guān)，普氏菌的豐度與細糧的攝入量呈正相關(guān)，軟壁菌門的豐度與蔬菜、水果的攝入量呈正相關(guān)（表4）。

表4 飲食結(jié)構(gòu)與菌群差異的相關(guān)性分析

3 討論

現(xiàn)已有多項研究表明不同種族和民族的健康個體腸道菌群存在差異。一項來自歐洲和美國的6個臨床中心對1型糖尿?。═1DM）基因高危嬰兒的糞便菌群分析結(jié)果揭示了地理來源與不同腸道菌屬的多樣性和相對豐度之間的顯著關(guān)聯(lián)，尤其是雙歧桿菌、Veillonella、糞桿菌、鏈球菌和阿克曼氏菌[8]。本研究的目的意在證實非疾病藏族與漢族人群腸道菌群存在差異，并探討其差異的原因。

本研究選取的研究對象均來自青海省高海拔地區(qū)，平均海拔3 200 m的海南藏族自治州共和縣，該地區(qū)農(nóng)、牧資源豐富，藏族人群仍然保留了原始游牧民族的飲食習(xí)慣，兩組人群生活的地理環(huán)境相同，避免了地理環(huán)境因素對于腸道菌群的干擾。兩組人群一般情況無明顯差異，腸道菌群16S rRNA基因高通量測序顯示稀釋性曲線平坦，說明數(shù)據(jù)合理，提示兩組人群腸道菌群多樣性無明顯差異，均以擬桿菌門和厚壁菌門為核心菌群，但具體菌種的相對豐度存在差異。PCoA分析顯示兩組人群組內(nèi)有聚類，組間分離明顯，提示兩組人群腸道菌群存在差異，但有混雜情況，需擴大樣本量排除混雜因素。

生活方式、遺傳、年齡、營養(yǎng)、藥物和環(huán)境等因素均可導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化，有研究表明生活方式（尤其是飲食結(jié)構(gòu)）對腸道菌群的影響超出遺傳和種族因素，如：成年雙胞胎中，同卵雙胞胎的腸道菌群并沒有比異卵雙胞胎的腸道菌群更相似，提示腸道菌群的遺傳能力較弱，故本研究考慮飲食結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致藏、漢族人群腸道菌群差異的主要因素。

問卷調(diào)查結(jié)果顯示藏族人群與漢族人群飲食結(jié)構(gòu)存在顯著差異。青稞、酥油、酸奶和茶為藏族人群的主要飲食組成，粗糧（青稞糌粑）占主食比例的大部分，牛、羊肉攝入較多，蔬菜、水果攝入較少，土豆為主要蔬菜，油脂攝入以動物油（酥油）為主，植物油比例較低，日常飲品以酥油茶和酸奶為主，飲食特點為高脂肪、高蛋白。漢族人群主食以面食（拉面、面片）為主，豬肉、蔬菜、水果及植物油攝入較多，牛、羊肉及動物油攝入較少。擬桿菌為蛋白水解菌[9]，可發(fā)酵腸道內(nèi)蛋白水解菌降解蛋白質(zhì)，故在高蛋白飲食為主的人群腸道菌群中擬桿菌數(shù)量增加[10]，高蛋白飲食在腸道內(nèi)被菌群分解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可調(diào)控人體的腸道黏膜免疫，降低慢性炎癥反應(yīng)，改善代謝狀態(tài)，這可能是藏族人群疾病發(fā)病率普遍低于漢族人群的原因。普氏菌有降解多糖、形成短鏈脂肪酸，分解碳水化合物和植物性蛋白質(zhì)的作用，產(chǎn)生的乙酸可進入外周循環(huán)代謝合成膽固醇，故在復(fù)雜植物多糖為主食的人群腸道菌群中含量較高[11]，漢族人群長期進食大量碳水化合物，故腸道內(nèi)易富集普氏菌。本研究調(diào)查顯示藏族人群飲食以高蛋白為主（牛羊肉較多），缺少膳食纖維，漢族人群飲食以碳水化合物為主，我們推測這種飲食結(jié)構(gòu)的差異，可能導(dǎo)致了腸道菌群的差異。

綜上所述，本研究顯示高海拔地區(qū)藏族和漢族人群腸道菌群存在明顯差異，這種差異除了與遺傳背景相關(guān)外，飲食結(jié)構(gòu)不同對腸道菌群組成的影響也不容忽視。飲食結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致腸道菌群的差異，但其具體的影響機制尚不明確，未來還需更深入的研究。通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)來影響腸道菌群結(jié)構(gòu)為我們治療相關(guān)疾病提供了新的思路。