支 尹，萬岱維，余 淼，張 喆，王 進(jìn)，張 鵬，董曉強(qiáng)

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市獨(dú)墅湖醫(yī)院，江蘇 蘇州 215125；3.淮安市腫瘤醫(yī)院，江蘇 淮安 223300）

胃癌是世界上第六大最常見的癌癥，其死亡率排名全球第四。根據(jù)《2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報告》[1]，胃癌年發(fā)病人數(shù)為108.9萬 人，占所有腫瘤發(fā)病人數(shù)的5.6%，死亡數(shù)為76.8萬 人，占所有癌癥病死人數(shù)的7.7%。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《胃癌診療規(guī)范（2018年版）》[2]數(shù)據(jù)顯示，中國每年新增胃癌病例近50萬 例，相當(dāng)于每天確診近1 400人。傳統(tǒng)的胃癌診治方案是手術(shù)，同時輔以放療或化療。但由于胃癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床癥狀不典型，缺乏有效的早期診斷特征，胃癌患者被診斷時多為晚期，使得胃癌患者五年生存率差。因此，尋找可靠的早期胃癌診斷工具，對于胃癌患者的生存及預(yù)后頗為重要。

非編碼RNA[3]不編碼蛋白質(zhì)，主要參與多種細(xì)胞活動，如基因沉默和激活、RNA剪接、修飾和編輯、蛋白質(zhì)翻譯等。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）[4]是一種新型的非編碼RNA，它具有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，主要在真核細(xì)胞中表達(dá)。circRNA由線性前體信使RNA（mRNA）的非經(jīng)典切割而成，顯示出共價連續(xù)的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，沒有3'帽子結(jié)構(gòu)和5'多聚腺苷酸尾。circRNA主要來源于內(nèi)含子與外顯子，它能夠抗核酸外切酶，具有穩(wěn)定性高、進(jìn)化保守性好、半衰期長等特點(diǎn)。

本研究通過基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus, GEO）檢索并分析獲得胃癌組織中的circRNA表達(dá)矩陣，發(fā)現(xiàn)circ_102476在胃癌組織中明顯下調(diào)，基于此進(jìn)一步討論circ_102476在胃癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù) 從GEO中下載胃癌標(biāo)本的circRNA數(shù)據(jù)集。獲取的GSE89143數(shù)據(jù)集共包括3 例胃癌組織及3 例胃癌癌旁組織，并通過GPL19978 Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1平臺進(jìn)行分析，將探針矩陣轉(zhuǎn)換為circRNA矩陣，共獲得2 558 個circRNA。

1.2 數(shù)據(jù)分析 在R語言平臺對circRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[5]。利用R語言中的“l(fā)imma”包進(jìn)行差異分析[6]，篩選條件為|log2FC|＞1，（BH法）P值＜0.05，得到GSE89143數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)circRNA。R語言“ggplot2”包[7]用于繪制差異表達(dá)circRNA火山圖；R語言“circlize”包[8]用于繪制聚類分析熱圖。獲取差異表達(dá)最明顯的前10位circRNA。

1.3 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未曾接受任何放化療、靶向治療等治療，術(shù)后組織病理學(xué)診斷為腺癌?；仡櫺允占?014年3月—2019年3月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科就診的92 例胃癌患者的胃癌及癌旁組織標(biāo)本。獲得的標(biāo)本立即儲存在液氮中。收集其他臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度等。

1.4 試劑和儀器 Trizol（Invitrogen公司）試劑用于提取RNA。上海生物生工有限公司合成circ_102476及內(nèi)部參考GAPDH的引物。上海吉凱公司提供cDNA試劑盒、PCR試劑盒。使用2－ΔΔCt法分析和計(jì)算基因的相對表達(dá)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度法測定RNA濃度和純度，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)部參照基因，提取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，1 次PCR循環(huán)；95 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，40 次PCR循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物列表Tab.1 Sequence list

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，卡方檢驗(yàn)用于相關(guān)性分析，建立受試者工作特征曲線（ROC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA差異分析 數(shù)據(jù)集GSE89143中包含3 個胃癌組織及3 個癌旁組織共6 個樣本，經(jīng)處理共獲得circRNA 2 558 例，據(jù)此繪制了胃癌組織及癌旁組織中circRNA表達(dá)的散點(diǎn)圖（見圖1）。對獲得的circRNA進(jìn)行差異分析，條件為|log2FC|＞2且P＜0.05，共篩選出99 例circRNA，其中上調(diào)1 例，下調(diào)98 例，根據(jù)篩選結(jié)果繪制了火山圖及聚類分析熱圖（見圖2、圖3）。差異表達(dá)最明顯的10 例circRNA見表2，其中hsa_circRNA_102476下調(diào)最顯著。

表2 GSE89143中差異表達(dá)的circRNATab.2 Differentially expressed circRNAs list

圖1 circRNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 circRNA expression in gastric cancer tissues and adjacent tissues

圖2 差異表達(dá)circRNA火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed circRNAs

圖3 circRNA聚類分析熱圖Fig.3 Heatmap of differentially expressed circRNA

2.2 circ_102476在胃癌組織中的表達(dá) 采用qRT-PCR方法對92 例胃癌患者的腫瘤標(biāo)本和配對癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行檢測。檢測數(shù)據(jù)顯示胃癌組織中circ_102476的相對表達(dá)量較癌旁組織顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖4）。

圖4 circ_102476在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.4 Expression of circ_102476 in gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.3 circ_102476相關(guān)臨床病理特征 依據(jù)circ_102476在胃癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)量，將患者分為下調(diào)組及上調(diào)組。相關(guān)臨床病理特征分析（見表3）顯示，circ_102476的表達(dá)水平與胃癌的臨床分期（P＝0.037）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＝0.026）和分化程度（P＝0.030）相關(guān)，且當(dāng)腫瘤較晚期、分化越差、產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，circ_102476下調(diào)明顯。

表3 circ_102476相關(guān)臨床病理特征Tab.3 Relationship between circ_102476 expression and clinical features of 92 patients with gastric cancer

2.4 circ_102476在胃癌診斷中的臨床價值 以circ_102476在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線（見圖5）。分析結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.75，最佳截斷值為24.95。

圖5 circ_102476的ROC曲線Fig.5 ROC curve analysis for gastric cancer

3 討論

胃癌作為全球最常見的惡性腫瘤之一，在亞洲地區(qū)的發(fā)病率較高。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胃癌的病死率有所下降，但由于經(jīng)常伴隨淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，該疾病預(yù)后仍然較差。因此，發(fā)現(xiàn)有效的診斷工具，對胃癌的早期診治極為重要。

自然界中，生物體中存在多種功能復(fù)雜的RNA，根據(jù)是否編碼，它們一般被分為編碼RNA和非編碼RNA兩大類。編碼RNA通常指的是mRNA。非編碼RNA是從基因組轉(zhuǎn)錄而成的RNA，不編碼蛋白質(zhì)，包括已知功能的RNA，如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA，也有未知功能的RNA[9]。非編碼RNA根據(jù)堿基數(shù)可分成3類：長度大于500 nt的長非編碼RNA；長度為50～500 nt，如rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等；長度小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA。這些非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要作用。

circRNA是一種特殊的非編碼RNA。50 年前，當(dāng)circRNA首次在病毒中被發(fā)現(xiàn)時，它被誤認(rèn)為是一種由外顯子轉(zhuǎn)錄本錯誤剪接形成的低豐度RNA分子。隨著基因測序技術(shù)和生物物理學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對circRNA研究逐漸深入，circRNA已被證明具有半衰期長、高度穩(wěn)定、進(jìn)化保守等特點(diǎn)，相比于其他的非編碼RNA不易被核酸內(nèi)切酶水解[10]。因此，在疾病的診斷和治療中，circRNA比其他非編碼RNA具有一定的優(yōu)勢。

近年來，各種研究報道證實(shí)circRNA的許多成員廣泛參與各種疾病進(jìn)展。Stoll和Xu等[11-12]發(fā)現(xiàn)，circHiPK3在糖尿病中與mir-124-3p海綿結(jié)合，調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞的功能。Holdt等[13]報道，circaNriL能夠調(diào)控血管細(xì)胞和組織的凋亡和增殖，起到預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。除了常見的慢性疾病外，circRNA在各種腫瘤中廣泛表達(dá)，起著重要的調(diào)控作用。Zong等[14]報道稱circ_102231在肺癌組織中顯著表達(dá)，可以作為肺癌的分子生物標(biāo)志物。Chen等[15]通過敲低circRNA_0000285抑制FUS的表達(dá)，從而抑制宮頸癌的形成和轉(zhuǎn)移。Liu等[16]證實(shí)circ_001783作為miR-200c-3p的“海綿”與之結(jié)合，調(diào)控ZEB1/2和ETS1，推動了乳腺癌的進(jìn)展。然而，目前有關(guān)胃癌中circRNA的表達(dá)與作用報道較少，相關(guān)的作用機(jī)制與通路仍有待探索。

GEO是一個公共功能基因數(shù)據(jù)存儲庫，提供檢索工具幫助用戶查詢和下載實(shí)驗(yàn)和測序的基因表達(dá)譜。本文通過檢索關(guān)鍵詞“circRNA”、“gastric cancer”發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜芯片GSE89143，獲得3 對胃癌和癌旁共6 例樣本。分析兩組circRNA表達(dá)水平的差異，篩選出差異倍數(shù)在2倍以上的circRNA共99 例，其中，circRNA在胃癌中表達(dá)較癌旁上調(diào)1例，下調(diào)98 例，circ_102476下調(diào)最為顯著（logFC＝－3.006，P＝0.012）。通過circBase及CSCD數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，circ_102476來自于19號染色體，親本基因?yàn)镸YO9B，它是由MYO9B的10-12號外顯子環(huán)化形成，長度為342 bp。

隨后的研究中，我們依照一定的納入標(biāo)準(zhǔn)，選取了92 例胃癌患者的組織標(biāo)本。qRT-RCR檢測顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中circ_102476的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。這一結(jié)果與挖掘數(shù)據(jù)庫所獲取的結(jié)論相一致。對結(jié)合記錄所得患者的臨床相關(guān)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果提示腫瘤較晚期（P＝0.037）、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＝0.026）、分化程度較差（P＝0.030）是circ_102476表達(dá)下調(diào)的相關(guān)因素，預(yù)示著其既可以用于胃癌的診斷，也可能對胃癌患者腫瘤的進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測。為了評估circ_102476診斷胃癌的效能，繪制了circ_102476表達(dá)的ROC曲線，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積AUC為0.75，提示circ_102476具有一定的診斷價值。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法獲得胃癌組織樣本中差異表達(dá)的circRNA，其中circ_102476下調(diào)最明顯（logFC＝－3.006，P＜0.05），經(jīng)qRT-PCR檢測驗(yàn)證其在胃癌中表達(dá)下調(diào)，可能與胃癌的臨床分期、分化程度、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明該基因可能參與了疾病進(jìn)展的過程。這一結(jié)果表明，circ_102476可作為胃癌早期診斷的工具。然而，circ_102476在胃癌中的作用機(jī)制和信號通路尚不清楚，仍需要未來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。