郭玉冰，王 皓，谷云飛

（洛陽市中心醫(yī)院，河南 洛陽 471000）

心肌細(xì)胞凋亡在諸多類型心血管疾病發(fā)生及演變過程中發(fā)揮推進(jìn)作用，該過程所需時間極為短暫，復(fù)雜程度極高又易被忽略，且其啟動和演變過程涉及諸多基因調(diào)節(jié)，故揭示心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因素及其調(diào)節(jié)機(jī)制有利于為疾病早期評估及治療提供新靶點(diǎn)[1-2]。微小RNA （microRNA, miRNA）具有基因調(diào)控功能，可參與各種心臟疾病病理生理環(huán)節(jié)[3]。相關(guān)報道[4-5]顯示，許多類型miRNA在正常成熟心臟組織中的表達(dá)水平較其他組織顯著增加，如miR-1、miR-133、miR-208等，若以上miRNA表達(dá)水平出現(xiàn)異?？蓪?dǎo)致其下游相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而在諸多病理過程介導(dǎo)下引發(fā)相關(guān)疾病。既往研究[6]已證實，miRNA可作用于細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成等諸多生理病理過程并扮演重要角色。微小RNA-199a-5（microRNA-199a-5p,miR-199a-5p）屬于miRNA家族成員，其在缺氧環(huán)境下表達(dá)量明顯減少，可解除對其靶基因缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）表達(dá)的抑制，導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)水平升高進(jìn)而降低細(xì)胞凋亡[7]。另有報道[8]顯示，上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)后可成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。miR-199a-5p在心肌細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制還尚未見報道。諸多研究報道證實，心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致正常心肌細(xì)胞損失，這是引發(fā)心力衰竭產(chǎn)生的重要機(jī)制，而miRNA可廣泛參與細(xì)胞凋亡[9]。故本次研究旨在探究miR-199a-5p對心臟缺血再灌注細(xì)胞模型細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 H9C2細(xì)胞株購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑：實時熒光定量PCR試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TUNEL試劑盒購于武漢純度生物科技有限公司；Trizol購于哈爾濱新?；驒z測有限公司；MTS試劑盒購于上海哈靈生物科技有限公司；胎牛血清購于武漢普諾賽生命科技有限公司；胰酶購于滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；兔抗HIF-1α、GSK3β、p-GSK3β抗體購于南京賽泓瑞生物科技有限公司。

1.2.2 儀器：超凈工作臺購于廣州浩翰儀器有限公司；低速離心機(jī)購于南京貝登醫(yī)療股份有限公司；－80 ℃超低溫冰箱購于北京祥生興業(yè)科技有限公司；實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀購于廣州輝駿生物科技股份有限公司。

1.3 方法 (1)利用H9C2細(xì)胞株建立氧糖剝奪再灌注模型，模擬心肌細(xì)胞缺血再灌注。利用miR-199a-5p inhibitor抑制H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)，細(xì)胞分組為空白對照組、模型組、miR-199a-5p inhibitor組。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測空白對照組、模型組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)水平。(2)采用MTT法檢測各組H9C2細(xì)胞活力。將生長狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞株按1×104/孔植于96孔板中，每孔均更換100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，并加入20 μL MTS，然后將其放入避光處孵育1 h，酶標(biāo)儀于OD值4 890 nm處測定每孔吸光度值。(3)應(yīng)用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測法分析各組H9C2細(xì)胞凋亡能力，取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)灌，然后采用PBS液沖洗3 次，每孔中注入300 μL 4%多聚甲醛，并于室溫下固定20 min，再次采用PBS液沖洗3 次，每孔中注入1% 200 μL Triton X-100溶液，并置于室溫下5 min，促進(jìn)其滲透，采用PBS液沖洗3 次，取提前配置好的50 μL TdT酶反應(yīng)液注入每孔，放入37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h，采用PBS液沖洗3 次，取Streptavidin-Fluorescein反應(yīng)液注入每孔，放入37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，采用PBS液沖洗3 次，取DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核7 min，采用PBS液沖洗3 次，最后應(yīng)用90%甘油封片，并置于倒置顯微鏡下觀察。每組H9C2細(xì)胞凋亡率以綠色熒光細(xì)胞核占藍(lán)色熒光細(xì)胞核百分比表示。(4)應(yīng)用Western blot檢測各組H9C2細(xì)胞中HIF-1α、糖原合成激酶3β（Glycogen synthesis kinase 3β,GSK3β）、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平。吸棄管內(nèi)的培養(yǎng)液，加入冷PBS液沖洗細(xì)胞2 次；將貼壁細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞混合液置于離心機(jī)，以1 000 r/min離心10 min，加入PBS液沖洗，置于離心機(jī)，以1 000 r/min離心5 min；加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑混勻，置于冰上數(shù)分鐘備用；將細(xì)胞沖洗后置于預(yù)冷的離心管，加入Lysis Buffer混合液后，置于搖床上震蕩30 s，置于冰上數(shù)分鐘，置于離心機(jī)以14 000 r/min離心5 min等待檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 18.0處理，各組H9C2細(xì)胞OD值、凋亡率等計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差或student's-t分析，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。各實驗均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平比較 利用H9C2細(xì)胞株建立氧糖剝奪再灌注模型，模擬心肌細(xì)胞缺血再灌注。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)模型組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。（表1）

表1 各組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平比較（±s，n＝9）

表1 各組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平比較（±s，n＝9）

分組 miR-199a-5p空白對照組 1.00±0.01模型組 4.98±0.42 t 29.958 P＜0.001

2.2 敲低miR-199a-5p對各組H9C2細(xì)胞活力及凋亡的作用 采用MTT法和TUNEL染色分別檢測各組H9C2細(xì)胞活力，研究發(fā)現(xiàn)模型組H9C2細(xì)胞OD值顯著低于空白對照組，凋亡率顯著高于空白對照組（P＜0.05）。miR-199a-5p inhibitor組H9C2細(xì)胞OD值顯著高于模型組，凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）。（表2，圖1）

表2 各組H9C2細(xì)胞OD值、凋亡率比較（±s，n＝9）

表2 各組H9C2細(xì)胞OD值、凋亡率比較（±s，n＝9）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

分組 OD值 凋亡率（%）空白對照組 1.05±0.05 4.23±0.12模型組 0.69±0.15* 38.12±4.15*miR-199a-5p inhibitor組 0.98±0.09# 12.45±2.05#

圖1 各組H9C2細(xì)胞凋亡能力比較

2.3 敲低miR-199a-5p對各組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β、GSK3β蛋白表達(dá)水平的作用 應(yīng)用Western blot檢測各組H9C2細(xì)胞中HIF-1α、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)模型組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對照組。miR-199a-5p inhibitor組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.05）。（表3，圖2）

表3 各組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝9）

表3 各組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝9）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

分組 HIF-1α p-GSK3β/GSK3β空白對照組 1.00±0.02 1.12±0.05模型組 0.69±0.05* 0.64±0.03*miR-199a-5p inhibitor組 0.82±0.02# 0.91±0.06#

圖2 各組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

雖然當(dāng)前社會醫(yī)療水平高速發(fā)展，且人們對疾病預(yù)防及早期評估日益重視，然而心血管疾病仍是引發(fā)人們死亡的主要原因之一[10]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，心血管疾病導(dǎo)致人類死亡總數(shù)占全球人類死亡總數(shù)的30%左右，而出現(xiàn)急性心肌梗死的患者經(jīng)溶栓治療或冠脈介入治療后導(dǎo)致的心肌缺血再灌注損傷是臨床尚未解決的難題之一。臨床文獻(xiàn)[11]顯示，氧自由基、心肌細(xì)胞凋亡等因素均可誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷，然而其具體作用機(jī)制并未完全闡釋。隨著研究的不斷深入，已有多項報道顯示miRNAs可用于評估心血管疾病。臨床研究[12]顯示，miRNAs可通過其相關(guān)靶基因調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，參與相關(guān)生物學(xué)行為。另有報道[13]顯示，miRNAs組織特異性明顯，其不僅可參與心血管系統(tǒng)病理生理狀態(tài)，亦與血管性疾病聯(lián)系緊密。miR-199a-5p可參與阿托伐他汀干預(yù)心肌缺血再灌注損傷相關(guān)環(huán)節(jié)并發(fā)揮關(guān)鍵作用。臨床研究[14]顯示，在低氧環(huán)境下miR-199a表達(dá)水平減少，HIF-1及血管生長因子表達(dá)水平增加，最終達(dá)到緩解心肌組織血供及氧供的目的。HIF作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其與氧聯(lián)系緊密，可參與機(jī)體對低氧環(huán)境適應(yīng)過程及腦卒中等疾病病理相關(guān)環(huán)節(jié)[15]。HIF-1由α、β兩種亞基構(gòu)成，其中α在整個過程中的作用更為重要。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，HIF-α在正常環(huán)境下不易被檢測到，僅少量可進(jìn)入胞核并結(jié)合HIF-1β進(jìn)而產(chǎn)生HIF-1復(fù)合物而發(fā)揮重要作用。臨床研究報道，HIF-1α可通過激活諸多類型基因表達(dá)進(jìn)而作用于糖酵解、葡萄糖攝取等過程。除此之外，HIF-1α對缺氧心肌作用亦具有雙重性，其過度被活化可導(dǎo)致心肌惡化。GSK-3β活化后可加速細(xì)胞凋亡，失活可阻斷細(xì)胞凋亡。臨床研究顯示，相關(guān)上游信號通路活化后可阻斷GSK-3β活性，進(jìn)而阻斷1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶開放，最終達(dá)到緩解心肌缺血再灌注損傷的目的。本研究結(jié)果顯示，模型組H9C2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。miR-199a-5p inhibitor組H9C2細(xì)胞OD值顯著高于模型組，凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）。說明敲低miR-199a-5p表達(dá)水平后可明顯緩解H9C2細(xì)胞糖氧剝奪復(fù)氧復(fù)糖損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞活力減少，此外亦具有阻斷細(xì)胞凋亡的作用。miR-199a-5p inhibitor組H9C2細(xì)胞HIF-1α、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.05）。說明miR-199a-5p可通過調(diào)控HIF-1α、p-GSK3β表達(dá)水平以達(dá)到改善心臟缺血再灌注損傷的目的。

綜上所述，miR-199a-5p在心臟缺血再灌注細(xì)胞模型中的表達(dá)水平增加，敲低其表達(dá)水平后可抑制細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)HIF-1α、p-GSK3β表達(dá)水平實現(xiàn)的。