權(quán)秋穎，郭凌川，黃 山，何曉順，陳 志，郭 霞，曹 磊

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215006）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率占全世界癌癥死亡率的第四位，其致病危險(xiǎn)因素如高能量飲食，肥胖，吸煙，缺乏鍛煉等增加了CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]；而遺傳易感因素如APC基因的缺失，RAS基因家族如KRAS和NRAS突變或P53基因的失活等在CRC的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用[2-3]。其中，錯(cuò)配修復(fù)蛋白的失活（dMMP）導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）的過(guò)表達(dá)也在腫瘤的發(fā)生中扮演特定角色。

微衛(wèi)星（microsatellite），是指存在于基因組中小片段核苷酸重復(fù)序列，包括編碼和非編碼區(qū)，而MSI是由于錯(cuò)配修復(fù)蛋白或基因的失活導(dǎo)致無(wú)法糾正DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加，進(jìn)而發(fā)展為腫瘤。研究[2]表明，在轉(zhuǎn)移性CRC患者中，15%的病例可檢測(cè)到MSI，其中3%與林奇綜合征（Lynch syndrome）的發(fā)生相關(guān)，12%的散發(fā)病例與MLH1高甲基化相關(guān)，50%的患者同時(shí)具有BRAFV600E活化突變。而相對(duì)于微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable, MSS）的CRC，存在MSI的CRC多具有較獨(dú)特的發(fā)生部位和組織學(xué)表型及治療方法。

Her-2作為酪氨酸激酶家族的一員，位于17號(hào)染色體，編碼185 kD的跨膜蛋白，表達(dá)在正常細(xì)胞，其激活可以啟動(dòng)如MAPK和PI3K/AKT等一系列信號(hào)通路，從而對(duì)細(xì)胞的增殖及分化產(chǎn)生重要作用，研究[4]表明Her-2可在多種惡性腫瘤包括CRC中過(guò)表達(dá)。在5%的轉(zhuǎn)移性CRC中可檢測(cè)到Her-2擴(kuò)增，其在乳腺癌及胃癌中是重要的生物標(biāo)志物，但在CRC中的作用尚不完全清楚。有研究者[5-6]認(rèn)為，Her-2的過(guò)表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，且在直腸的發(fā)生率最高。但Her-2與微衛(wèi)星狀態(tài)之間的關(guān)系在CRC中尚未闡明，因此，探討MSI和Her-2在CRC的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系具有重要意義。

本研究通過(guò)免疫組化方法探討CRC中錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Her-2的表達(dá)，旨在為CRC病人的精準(zhǔn)治療提供一定的理論依據(jù)，對(duì)臨床選擇合適的病人亞群采用合適的治療方法提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年1月1日—12月31日蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的CRC標(biāo)本共493 例，所有患者術(shù)前均未行放化療或其他治療，術(shù)后經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師診斷均為腺癌。其中男性共284例，女性共209 例；年齡范圍21～91 歲，中位年齡66 歲；左半結(jié)腸156 例，右半結(jié)腸184 例，直腸153例；423 例為中＋高分化，70 例為低分化；病理分期標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第八版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 所有標(biāo)本固定后均經(jīng)脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚切片，采用全自動(dòng)免疫組化染色儀，抗體MLH1（Clone ES05）、PMS2（Clone EP51）、MSH2（Clone FE11）和MSH6（Clone EP49）均購(gòu)自Dako公司，即用型；Her-2（Clone 4B5），購(gòu)自VENTANA公司。

1.3 結(jié)果判讀 經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)師雙盲讀片，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核，染色呈棕黃或棕褐色（圖1，見(jiàn)封二），胞核不著色為表達(dá)缺失（圖2，見(jiàn)封二）；存在2個(gè)或2個(gè)以上蛋白表達(dá)缺失定義為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-High, MSI-H），存在1個(gè)蛋白缺失或無(wú)缺失者定義為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（microsatellite instability-Low, MSI-L）或MSS；Her-2表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上，染色呈淺黃或棕黃色，其評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)反應(yīng)或＜10%腫瘤細(xì)胞膜染色判為Her-2（-），≥10%腫瘤細(xì)胞微弱可見(jiàn)膜染色判為Her-2（1＋），≥10%腫瘤細(xì)胞有弱到中等的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色判為Her-2（2＋），≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)染色判為Her-2（3＋）（圖3）。

A：Her-2 (-)；B：Her-2 (1＋)；C：Her-2 (2＋)；D：Her-2 (3＋)。圖3 Her-2在CRC中的免疫組化表達(dá)（10×10）A: Her-2 (-); B: Her-2 (1＋); C: Her-2 (2＋); D: Her-2 (3＋).Fig.3 The Immunohistochemical expression of Her-2 in CRC (10×10)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05認(rèn)為兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSI和Her-2在CRC中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 與正常腸黏膜相比，493 例CRC手術(shù)標(biāo)本中，MSI-H病例數(shù)共43 例，發(fā)生率為8.7%，MSI-L與MSS兩組在性別、年齡、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故將MSI-L與MSS歸為一組進(jìn)行研究，MSI-L/MSS共450 例，發(fā)生率為91.3%；與MSI-L/MSS相比，MSI-H的CRC患者腫瘤好發(fā)于右半結(jié)腸（P＜0.001），浸潤(rùn)較深（P＝0.024），低分化（P＜0.001），瘤體較大（P＝0.001），組織學(xué)類型多為黏液腺癌（P＜0.001），與其他指標(biāo)如性別、年齡、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）（表1）；Her-2在CRC中高表達(dá)狀態(tài)多見(jiàn)于低分化者（P＜0.05），亦與腫瘤發(fā)生部位相關(guān)，直腸多見(jiàn)（P＜0.05）（表2）。

表1 MSI-H與MSS/MSI-L的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab.1 Relationship between the expression of MSI-H and MSS/MSI-L and clinicopathological features

表2 Her-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab.2 Relationship between the expression of Her-2 and clinicopathological features

2.2 MSI與Her-2表達(dá)的相關(guān)性 MSI與Her-2的表達(dá)呈正相關(guān)（P＝0.021，r＝0.140）（表3）。

表3 MSI與Her-2表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 The correlation between MSI and Her-2 expression

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展與一系列基因突變累積相關(guān)，具有多遺傳模型，每年約占新診斷癌癥病例的10%，MSI被認(rèn)為是導(dǎo)致CRC發(fā)生的主要原因之一，它代表了遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），即林奇綜合征的分子表型，通常與胚系突變有關(guān)，同時(shí)也可在散發(fā)性病例中檢測(cè)到，多與MLH1表觀遺傳失活相關(guān)[7]。檢測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)至關(guān)重要，它可作為篩查林奇綜合征的工具，同時(shí)也可為評(píng)估患者的預(yù)后，對(duì)化療藥物及免疫治療的應(yīng)用提供參考和幫助。目前主要有兩種方法檢測(cè)MSI，包括PCR和免疫組織化學(xué)，二者對(duì)dMMR和MSI的檢測(cè)均敏感且特異，一致率大于95%[8]。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)，結(jié)果表明，MSI-H患者共43 例，既往研究[7]表明，MSI-H的患者腫瘤發(fā)生具有獨(dú)特的臨床病理特點(diǎn)，如右半結(jié)腸多見(jiàn)，浸潤(rùn)較深，組織學(xué)類型多為黏液或印戒樣表型，分化差，而MSI-L和MSS兩組之間無(wú)明顯差異，這與本研究結(jié)果一致，可能與近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸的不同胚胎學(xué)起源有關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H/dMMR的患者，由于腫瘤突變多，具有廣泛的免疫源性，腫瘤區(qū)域淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，免疫療法效果顯著，但對(duì)氟尿嘧啶類單藥治療不敏感。目前，PD-1免疫卡控點(diǎn)抑制劑如nivolumab或pembrolizumab已批準(zhǔn)用于dMMR或MSI-H的患者[9-10]，同時(shí)，聯(lián)合免疫治療（nivolumab和ipilimumab）也得到了美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）的批準(zhǔn)[11]，其效果顯著，腫瘤消退明顯，生存時(shí)間較MSI-L/MSS患者延長(zhǎng)，預(yù)后較好[12]。

Her-2作為腫瘤重要的驅(qū)動(dòng)因子，在乳腺癌和胃癌中已作為公認(rèn)的治療靶點(diǎn)，然而其在CRC的預(yù)測(cè)作用尚未明確。有報(bào)道[6]認(rèn)為，發(fā)生于遠(yuǎn)端CRC尤其是直腸的患者更容易檢測(cè)到Her-2或表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）擴(kuò)增，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)Her-2表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)，低分化腺癌中Her-2過(guò)表達(dá)多見(jiàn)，表明其在評(píng)估腫瘤的惡性程度方面存在一定價(jià)值。多組報(bào)道[13-14]認(rèn)為，相對(duì)于Her-2檢測(cè)陰性的患者，伴有Her-2擴(kuò)增的病人對(duì)抗EGFR治療如西妥昔單抗存在抵抗和耐藥，中位生存期和總生存期明顯縮短，是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的負(fù)性因子。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)使用西妥昔單抗或帕尼妥單抗或聯(lián)合化療治療KRAS野生型轉(zhuǎn)移性CRC的患者時(shí)，其生存均受Her-2基因拷貝數(shù)的影響，當(dāng)然，也有研究認(rèn)為，其擴(kuò)增與否與患者的預(yù)后之間不存在相關(guān)性。然而，在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用曲妥珠單抗（trastuzumab）和來(lái)那替尼（neratinib）或拉帕替尼（lapatinib）即雙重Her-2靶向藥治療可產(chǎn)生持久的腫瘤消退[15]。因此，檢測(cè)CRC患者中Her-2蛋白的表達(dá)對(duì)選擇治療方法及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。

有研究[16]表明，MSI和PIK3CA突變與ERBB2/ERBB3突變相關(guān)。最近一項(xiàng)報(bào)道[17]也發(fā)現(xiàn)，36.8%的MSI-H患者攜帶Her-2突變，且攜帶Her-2突變的MSI-H患者采用免疫治療PD-1抑制劑的中位PFS顯著低于無(wú)Her-2突變的患者。本研究結(jié)果顯示，MSI與Her-2的表達(dá)存在相關(guān)性，有研究者認(rèn)為這可能是由于錯(cuò)配修復(fù)導(dǎo)致突變發(fā)生率較高所致，具體機(jī)制尚需更深入的研究。此外，對(duì)同時(shí)存在Her-2突變與MSI的體外結(jié)直腸癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)不可逆EGFR抑制劑來(lái)那替尼效果更好[18]。綜上，聯(lián)合檢測(cè)MSI和Her-2在CRC中的表達(dá)可更好地評(píng)估腫瘤風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，為臨床分子靶向治療的選擇提供參考方向。