王相平，紀(jì)煜航，鄭 超，李 娜，李 鎮(zhèn)

（大連市第五人民醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116027）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢[1-2]。膀胱癌主要發(fā)生于膀胱黏膜，占我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[3-4]。膀胱癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)，如遺傳因素、吸入芳香族化合物等環(huán)境因素等[5]。但是目前關(guān)于膀胱癌發(fā)病的確切機(jī)制尚不明確。

JAK/STAT通路是細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的共同途徑，是細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵途徑[6]。JAK/STAT通路參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，如心肌缺血再灌注損傷、腎功能損傷及腎纖維化、心肌細(xì)胞損傷及心功能異常、腦組織疾病等[7-9]。已有的證據(jù)也表明，JAK/STAT通路也與多種腫瘤的病理學(xué)過程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成及凋亡等過程密切相關(guān)。大蒜素是存在于大蒜鱗莖中的具有抑菌作用的三硫代丙烯醚類化合物，具有降固醇、促進(jìn)血小板凝集及抗腫瘤的藥理活性[10]。本研究旨在探討膀胱腫瘤細(xì)胞T24凋亡的JAK/STAT3通路參與作用及大蒜素促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，為相關(guān)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人T24細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma Aldrich公司；MTT及JAK抑制劑ADZ1480化合物購自美國Sigma Aldrich公司；Caspase 3及Caspase 9單克隆抗體購自美國Abcam公司；Bax及Bcl2單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；JAK1、JAK2及JAK3單克隆抗體購自美國R&D公司；STAT1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；STAT3單克隆抗體購自O(shè)mega公司；HRP標(biāo)記二抗購自南京建成生物工程研究所；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海新苗儀器有限公司；蛋白垂直電泳購自北京六一儀器廠；半干法轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國ABI公司；硝酸纖維素膜購自默克密理博公司。

1.2 分組及處理 培養(yǎng)狀態(tài)良好的T24腫瘤細(xì)胞完全隨機(jī)分為5組：對照組、ADZ1480組和大蒜素1、2、3組。ADZ1480組細(xì)胞進(jìn)行10 μmol/L ADZ1480孵育處理，大蒜素1、2、3組細(xì)胞分別給予大蒜素1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L孵育處理。分別于處理24、36、48和72 h后分析細(xì)胞增殖抑制率，處理72 h后檢測相關(guān)蛋白分子的表達(dá)變化。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測腫瘤細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度藥物處理后于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、36、48及72 h，棄去培養(yǎng)液并加入適量MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入DMSO劇烈振蕩，采用全波長酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)板各個孔的吸光度值，計算藥物對細(xì)胞T24的增殖抑制率。計算公式：抑制率＝(對照組吸光度－試驗組吸光度)/對照組吸光度×100%。

1.4 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 人膀胱癌細(xì)胞T24經(jīng)相應(yīng)藥物處理后用無菌PBS沖洗3 次，然后于0 ℃水浴中進(jìn)行勻漿并提取總蛋白質(zhì)?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量后以等量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳溴酚藍(lán)條帶至凝膠下端后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后胎牛血清封閉。然后與一抗（1:250）在室溫條件下培養(yǎng)過夜，無菌PBS漂洗后與HRP標(biāo)記二抗（1:200）在室溫條件下雜交1 h，顯色。分析顯色后條帶的光密度，并以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)的定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件完成，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 3/9上調(diào)表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 3及Caspase 9的表達(dá)明顯升高，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)也明顯升高，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blotting分析細(xì)胞凋亡蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

2.2 大蒜素促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl2異常表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯升高，而抑制凋亡蛋白Bcl2表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)也明顯變化，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖2）

圖2 Western blotting分析Bax/Bcl2蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

2.3 大蒜素抑制T24腫瘤細(xì)胞增殖作用 MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480及大蒜素均能有效抑制T24腫瘤細(xì)胞的增殖，且每組細(xì)胞的增殖效果具有時間依從性；同時，研究也發(fā)現(xiàn)大蒜素3組抑制效果明顯強(qiáng)于大蒜素1組和大蒜素2組，提示大蒜素的抑制作用具有劑量依從性效果。（表1）

表1 MTT法檢測大蒜素對T24腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用（±s）

表1 MTT法檢測大蒜素對T24腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用（±s）

與同組24 h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與大蒜素1組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n抑制率（%）24 h 36 h 48 h 72 h ADZ1480組 20 16.9±5.5## 29.2±7.4*## 36.5±6.8**## 41.2±9.9**##大蒜素1組 20 5.4±1.2 6.2±1.7 7.5±1.3* 9.0±2.1*大蒜素2組 20 9.6±2.3# 11.7±3.6*# 12.6±2.7**# 15.8±2.6**#大蒜素3組 20 18.1±3.8## 20.3±3.4*## 25.9±4.9**## 32.3±3.5**##

2.4 大蒜素抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞JAK1/2/3蛋白表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后JAK信號通路關(guān)鍵蛋白JAK1、JAK2和JAK3的表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述蛋白表達(dá)也明顯降低，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖3）

圖3 Western blotting分析JAK1/2/3蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

2.5 大蒜素抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞STAT1/3蛋白表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后JAK信號通路關(guān)鍵蛋白STAT1和STAT3的表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述蛋白表達(dá)也明顯降低，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖4）

圖4 Western blotting分析STAT1/2蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

2.6 大蒜素抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞MMPs蛋白表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP2、MMP9和MMP12的表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)也明顯降低，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖5）

圖5 Western blotting分析MMP2、MMP9和MMP12蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

2.7 大蒜素抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24細(xì)胞TIMPs蛋白表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后基質(zhì)金屬蛋白酶家族抑制劑TIMP1和TIMP2的表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述蛋白表達(dá)也明顯降低，且具有劑量依從性效果（P＜0.05，P＜0.01）。（圖6）

圖6 Western blotting分析TIMP1及TIMP2蛋白分子在不同藥物處理膀胱癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異性

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。但是，目前關(guān)于膀胱癌的確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上也缺乏有效的治療藥物。因此，探究其發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)的治療藥物，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究在探討膀胱腫瘤細(xì)胞T24凋亡的JAK/STAT3通路參與作用及大蒜素促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480及大蒜素均能有效抑制T24腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑制效果具有時間和劑量依從性；藥物處理后細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase 3和Caspase 9表達(dá)升高而Bcl2表達(dá)降低，JAK通路蛋白JAK1、JAK2、JAK3和STAT1及STAT3表達(dá)升高，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9和MMP12及其抑制劑TIMP1和TIMP2表達(dá)明顯升高，也具有劑量依從性效果。因此，大蒜素能夠有效抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24增殖、促進(jìn)其凋亡，其可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞中過度激活的JAK/STAT通路實現(xiàn)的。

細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮藥理作用的主要機(jī)制，也是臨床上進(jìn)行藥物治療惡性腫瘤的重要思路。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的生理性過程，是細(xì)胞的程序化死亡過程。細(xì)胞凋亡是由一系列細(xì)胞凋亡蛋白介導(dǎo)的，如Bax/Bcl2蛋白、Caspase蛋白家族、C-Myc等。在研究丁酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用機(jī)制的論述中認(rèn)為抑癌基因p14、p16及p21和C-Myc信號通路共同參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程[11]。在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抑制卵巢癌3AO細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)配體可以通過抑制細(xì)胞增殖周期、激活細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用[12]。在分析PKC412聯(lián)合阿霉素對大鼠膀胱腫瘤生長及細(xì)胞凋亡影響的研究中也證實二者聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果明顯優(yōu)于單獨使用，且此過程中伴隨微血管密度的降低和CD31表達(dá)的下調(diào)[13]。陶鋒等[14]研究也發(fā)現(xiàn)耳葉牛皮消苷A代謝產(chǎn)物具有明顯的抗腫瘤活性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且其主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞處于G2M期。本研究也發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase 3和Caspase 9的表達(dá)明顯升高，而抑制凋亡蛋白Bcl2表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)也明顯變化，且具有劑量依從性效果，表明Bax/Bcl2及Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程是大蒜素促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。同時，在研究白芥子揮發(fā)油對小鼠肝癌H22移植性腫瘤的抑制作用時也證實Bax/Bcl2蛋白是引起細(xì)胞凋亡的主要因子[15]。

JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，且與多種腫瘤的生理過程密切相關(guān)[16]。在研究舒尼替尼抑制頭頸鱗癌細(xì)胞PCI-13增殖的研究中證實藥物主要通過阻斷STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[17]。在分析瘦素激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF7的遷移及侵襲的研究中也發(fā)現(xiàn)JAK信號通路參與了此過程[18]。與以往報道一致，本研究也發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑ADZ1480處理細(xì)胞后JAK信號通路關(guān)鍵蛋白JAK1、JAK2和JAK3及STAT1和STAT3的表達(dá)明顯降低，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同時，大蒜素1組和2組的上述蛋白表達(dá)也明顯降低，且具有劑量依從性效果，表明藥物主要通過抑制JAK/STAT3信號通路發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。

因此，大蒜素能夠有效抑制膀胱腫瘤細(xì)胞T24增殖、促進(jìn)其凋亡，其可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞中過度激活的JAK/STAT通路實現(xiàn)的。