譚 瀟 肖楚麗 肖 非 王 碩 （邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，邵陽(yáng)422000）

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，SJ）是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，可導(dǎo)致肝、腸組織損傷，形成病理性蟲卵肉芽腫和繼發(fā)性肝纖維化［1-2］。雖然吡喹酮能有效治療血吸蟲病感染，但無法控制患者重復(fù)感染［3］。因此，疫苗研究依然是防控血吸蟲病長(zhǎng)期有效的策略。目前血吸蟲病的疫苗研究主要經(jīng)歷了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等，而且已經(jīng)篩選出多種疫苗候選分子［3-6］。但是其免疫保護(hù)性并沒有得到實(shí)際的臨床應(yīng)用。日本血吸蟲病表膜蛋白（oligo‐saccharide transferase，SjOST48）是一種二磷酸寡糖轉(zhuǎn)移酶，能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜催化高甘露糖型寡糖，進(jìn)而參與鋅蛋白質(zhì)N-連接糖基化修飾過程［7-8］。目前這類蛋白質(zhì)主要存在于外膜蛋白、分泌型蛋白和體液蛋白中，通常作為診斷抗原和治療靶標(biāo)［8］。LIU等［7］證實(shí)血吸蟲重組表膜蛋白OST48具有較好的免疫原性，并且對(duì)血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，同時(shí)在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了部分免疫保護(hù)作用。盡管如此，SjOST48重組蛋白作為免疫保護(hù)性抗原仍然存在一定問題，主要體現(xiàn)在免疫效力較弱，持續(xù)時(shí)間較短等。DNA疫苗作為一種新的疫苗接種策略主要是通過肌肉注射將質(zhì)粒DNA注入到肌肉細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)長(zhǎng)期的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［9-10］。血吸蟲病表膜蛋白OST48蛋白的DNA疫苗研究尚未報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建表膜蛋白OST48的DNA疫苗，肌肉注射到BALA/c小鼠，評(píng)估其免疫應(yīng)答類型和抗血吸蟲病感染的免疫保護(hù)效果，以期為血吸蟲病臨床疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)有限公司（SCXK湘2016-0002）；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Goat anti-mouse IgG、IgG1、IgG2a二抗購(gòu)自Abcam公司；Mouse TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司；HeLa細(xì)胞、大腸桿菌E.coliBL21、血吸蟲尾蚴的陽(yáng)性釘螺和真核質(zhì)粒pcDNA3.1（+）由南華大學(xué)病原生物研究所惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 OST48真核載體構(gòu)建方法 依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)血吸蟲病表膜蛋白OST48蛋白引物（上游引物：5′-GAAGAGCTCGAGGACAAGCGGAAAAAT-3′，下游引物：5′-GCGCTCGAGTTATTCACCCTTTTCT-3′），通過PCR擴(kuò)增將OST48基因序列連接到pcDNA3.1（+）質(zhì)粒上。將構(gòu)建成功的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coilJM 109中培養(yǎng)，凝膠電泳鑒定成功后送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞 將成功提取的質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞。48 h后加入蛋白裂解液，冰上孵育30 min，離心（4℃，13 000/rmin，15 min），收集細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)pcDNA3.1/SjOST48在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.2.3 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn) 6～8周齡雌性BALB/c小鼠（100只）隨機(jī)分為5組：PBS組、pcDNA3.1（+）組、FA組、SjOST48重組蛋白組和pcDNA3.1/SjOST48組。每隔2周小鼠左后腿股四頭肌肌肉注射相對(duì)應(yīng)質(zhì)粒100μg或者等劑量PBS并尾部靜脈收集血清，共免疫3次，末次免疫2周后無菌分離小鼠脾淋巴細(xì)胞。本研究所有動(dòng)物均得到邵陽(yáng)學(xué)院動(dòng)物福利審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：SYXK2015-0001）。

1.2.4 血清抗體檢測(cè) ELISA法檢測(cè)各階段免疫小鼠血清抗體水平，將SjOST48重組蛋白稀釋后加入96孔ELISA檢測(cè)板中［10μg/(ml·孔）］，4℃ 過夜。將不同時(shí)間收集的小鼠血清倍比稀釋（1：100）后作為一抗加入至96孔板中孵育2 h（37℃），每孔100μl。HRP標(biāo)記的goat anti-mouse IgG、IgG1、IgG2a作為二抗（1：1 000）孵育1.5 h（37℃）。最后于450 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況 將無菌分離的脾淋巴細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于96孔板中。SjOST48重組蛋白（10μg/ml）刺激細(xì)胞。培養(yǎng)48 h（37℃，5%CO2）后每孔加入CCK-8溶液（10μl）繼續(xù)培養(yǎng)4 h（37℃，5%CO2）后，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各組OD值。刺激指數(shù)（SI）=（刺激組OD值-空白組OD值）/（未刺激組OD值-空白組OD值）。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子 同法將收集的小鼠脾淋巴細(xì)胞以2×105個(gè)/ml加入24孔板中。SjOST48重組蛋白（10μg/ml）刺激細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞上清，并按照細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10試劑盒說明書檢測(cè)各免疫小鼠的細(xì)胞因子水平。

1.2.7 肝組織病理切片 末次免疫2周后血吸蟲尾蚴感染小鼠，感染后6周麻醉處死小鼠，無菌分離肝臟組織后進(jìn)行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。采用UVP成像系統(tǒng)記錄100倍視野中10個(gè)肉芽腫的面積。

1.2.8 小鼠肝臟減卵率計(jì)算 將上述無菌分離的肝臟組織（0.5 g）剪碎，溶于5%KOH溶液37℃水浴5 h，收集懸液（500μl），顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵數(shù)。肝臟減卵率（%）=（對(duì)照組平均肝蟲卵數(shù)-免疫組平均肝蟲卵數(shù)）/（對(duì)照組平均肝蟲卵數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？贵w水平、刺激指數(shù)、細(xì)胞因子水平以及肝臟減卵率等數(shù)據(jù)均以±s表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（Oneway-ANOVA）。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1/SjOST48真核質(zhì)粒載體構(gòu)建和在HeLa細(xì)胞中表達(dá) 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48的菌液PCR鑒定結(jié)果顯示在1 248 bp處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期大小一致（圖1A），并且測(cè)序結(jié)果與SjOST48基因序列一致（圖1B）。將構(gòu)建成功的真核質(zhì)粒pcDNA3.1/SjOST48轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示在50 kD出現(xiàn)明顯條帶（圖1C），說明pcDNA3.1/SjOST48重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Sj OST48的PCR與Western blot鑒定Fig.1 PCR and Western blot identification of recombi?nant plasmid pcDNA3.1/SjOST48

圖2 免疫小鼠血清IgG以及IgG亞類水平Fig.2 Levels of serum IgG and IgG subclass in immu?nized mice

2.2 免疫小鼠血清中IgG及其亞類IgG1、IgG2a分泌水平 為了驗(yàn)證pcDNA3.1/SjOST48是否在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)一定水平的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過檢測(cè)不同時(shí)期血清中的抗SjOST48特異性抗體反應(yīng)，其結(jié)果顯示：免疫第2周即產(chǎn)生SjOST48特異性抗體，隨后抗體水平逐漸增加，并在第8周達(dá)到最大（1：25 600）（P＜0.05）（圖2A）。 此 外 ，pcDNA3.1/SjOST48同樣能夠增強(qiáng)小鼠血清中IgG1、IgG2a分泌水平，且IgG2a/IgG1的比值均大于1（圖2B）。

2.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平 CCK-8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平，圖3所示，末次免疫2周后，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（5.94±2.34）明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量 圖4結(jié)果顯示pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中TNF-α、IL-10和IFN-γ含量顯著增加（P＜0.05）。與此相反的是IL-4的分泌水平與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步證明了pcD‐NA3.1/SjOST48能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.5 HE染色法檢測(cè)小鼠肝臟病理變化及蟲卵數(shù)量 為了檢測(cè)pcDNA3.1/SjOST48是否能提供保護(hù)性免疫，控制血吸蟲病的感染，我們對(duì)血吸蟲感染后小鼠的肝臟進(jìn)行病理切片分析（圖5）。結(jié)果顯示，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的肝臟肉芽腫體積明顯小于PBS組及SjOST48重組蛋白組，并且肉芽腫的數(shù)量也明顯少于對(duì)照組；pcDNA3.1/SjOST48組的肝臟炎癥浸潤(rùn)情況較對(duì)照組明顯減輕，只有少量的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；通過對(duì)蟲卵數(shù)量的計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠的肝臟蟲卵數(shù)量也明顯少于對(duì)照組（表1），表明pcDNA3.1/SjOST48能顯著增強(qiáng)SjOST48的免疫保護(hù)作用，有效控制血吸蟲病的感染。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平Fig.3 Level of lymphocyte proliferation in immunized mice

圖4 免疫小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子檢測(cè)Fig.4 Levels of cytokines in spleen cell supernatant of im?munized mice

表1 各組小鼠減蟲率及肝組織減卵率（±s，n=15）Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group（±s，n=15）

表1 各組小鼠減蟲率及肝組織減卵率（±s，n=15）Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group（±s，n=15）

Note：Compared with control group（PBSand pcDNA 3.1），1）P＜0.05.

GroupsWorm burdenWormreductionAveragenumber of eggsLiver egg rate（%）per gram liver tissue（×104）reduction rate（%）PBS26.63±3.41-36.86±6.25- pcDNA3.125.83±2.45-36.32±4.31- FA25.31±3.62-35.61±3.56-SjOST4820.36±2.1523.541）28.63±3.6522.331）pcDNA3.1/SjOST4818.06±1.2111.301）23.67±2.5435.781）

圖5 各組小鼠肝臟病理變化（HE染色，×40）Fig.5 Histopathological changes in the liver after Schisto?soma japonicum infection in mice（HE，×40）

3 討論

目前國(guó)內(nèi)臨床上針對(duì)血吸蟲病的感染主要以抗生素治療為主，但是重復(fù)感染病例依然很嚴(yán)重，單靠藥物治療并不能有效控制血吸蟲病傳播［3，13］。因此，疫苗研究依然是防控血吸蟲病傳播的首選策略。LIU等［7］證實(shí)SjOST48蛋白主要位于血吸蟲表膜，并且作為寡糖轉(zhuǎn)移酶，在血吸蟲蟲卵生殖和病理?yè)p傷方面發(fā)揮著重要作用。同時(shí)在小鼠體內(nèi)也能誘導(dǎo)一定水平的免疫原性和免疫保護(hù)性。然而，這種重組抗原的免疫原性往往較差，而且不能產(chǎn)生免疫保護(hù)所需的免疫應(yīng)答類型，限制了其在臨床中的應(yīng)用。DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，目前已用于多種傳染病動(dòng)物模型的保護(hù)性研究［9，14］。而本研究通過構(gòu)建SjOST48 DNA疫苗來增強(qiáng)其免疫保護(hù)性效果，以期能在血吸蟲病疫苗的研制中提供理論基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)中我們同樣證實(shí)了SjOST48重組蛋白具有一定的保護(hù)性，能控制血吸蟲病的感染，但是其免疫保護(hù)效果并不理想。而血吸蟲疫苗產(chǎn)生的體液免疫在抗血吸蟲病過程中發(fā)揮的作用并不明顯，相反長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫主要依賴于Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)［4，15］。檢測(cè)抗體亞類結(jié)果顯示，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠血清中IgG2a/IgG1的比值均大于1，表明SjOST48的DNA疫苗能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。以往研究證明，Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)參與了血吸蟲病的免疫病理?yè)p傷，能夠促進(jìn)組織肉芽腫形成［12，16］。 此 次 實(shí) 驗(yàn) 中pcDNA3.1/SjOST48誘 導(dǎo) 的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制了Th2型細(xì)胞免疫，因此減輕了血吸蟲病肝臟的病理?yè)p傷，相較于重組SjOST48蛋白，DNA疫苗的免疫保護(hù)性更加明顯。研究表明Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫保護(hù)性是血吸蟲病清除的主要機(jī)制［11-12］。LIU等［17］發(fā)現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子TNF-α能夠募集大量的炎癥細(xì)胞介導(dǎo)肉芽腫形成而清除蟲卵。TNF-α主要是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子［18］。而pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中存在大量的TNF-α，因此說明SjOST48 DNA疫苗可能激發(fā)了先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而促進(jìn)宿主早期清除血吸蟲病感染。也有文獻(xiàn)指出血吸蟲病患者血清中能檢測(cè)到大量Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10），并且也證實(shí)這些細(xì)胞因子參與宿主體內(nèi)血吸蟲清除［15］。而pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠體內(nèi)INF-γ、IL-10和TNF-α的大量分泌以及IL-4分泌水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說明SjOST48 DNA疫苗能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。INF-γ是早期清除血吸蟲病感染最主要的Th1型細(xì)胞因子，能夠活化T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［11］。本研究中，pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠肝臟的病理切片中肉芽腫數(shù)量及面積明顯少于對(duì)照組。說明SjOST48 DNA疫苗誘導(dǎo)的Th1型細(xì)胞免疫保護(hù)性明顯優(yōu)于重組蛋白SjOST48。DNA疫苗雖然能同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但其免疫應(yīng)答強(qiáng)度和穩(wěn)定性受多方面的影響［19］。佐劑一直是疫苗研究的熱點(diǎn)，和重組抗原一樣，DNA疫苗也能通過佐劑增強(qiáng)免疫效果和穩(wěn)定性。因此，在未來研究中我們將重點(diǎn)探索SjOST48 DNA疫苗的佐劑篩選。

綜上所述，SjOST48 DNA疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的特異性SjOST48抗體，并且能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著增強(qiáng)其抗血吸蟲病感染的保護(hù)作用，為研制預(yù)防和控制抗血吸蟲病感染的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。但是DNA疫苗免疫原性和穩(wěn)定性的多方面影響仍然需要我們對(duì)其免疫保護(hù)機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。