李 潭 孫一涵 李國峰 （長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117）

炎癥是機體在受到各種炎癥因子的刺激和損傷后產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)，能使這些炎癥因子失活和清除，并為組織修復(fù)創(chuàng)造環(huán)境。但炎癥也是許多疾病的癥狀或并發(fā)癥。病毒、細菌為誘發(fā)炎癥的主要介質(zhì)，物理、化學(xué)、創(chuàng)傷及其他刺激亦會對其產(chǎn)生影響［1-2］。RAW264.7巨噬細胞是啟動體內(nèi)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中樞細胞［3］。在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面，其中心細胞是激活的巨噬細胞，也是許多炎癥因子的主要來源［4］。大量研究表明，中藥單體（天然化合物）對RAW264.7巨噬細胞具有較好的抑制作用［5］。以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞為靶點，通過中藥單體（天然化合物）的抗炎及促炎機制，可進一步了解炎癥反應(yīng)的作用機制，找到有效的防治措施［6］。

根皮素是一種果皮的天然提取物，主要來源于梨皮，石榴皮等果皮，這些果皮本身就具有瀉火燥濕、消腫的功效，現(xiàn)代藥理研究證實根皮素具有抗癌、抗結(jié)核和抗菌活性，但其抗炎的具體機制尚不明確［7-10］。中藥單體能通過多途徑、多靶點整合起效防治炎癥的進展。根皮素能否調(diào)控RAW264.7巨噬細胞表現(xiàn)出抗炎效果，國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻報道。本文以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞為研究靶點，運用ELISA、Western blot、實時熒光定量PCR、免疫熒光等方法觀察根皮素對炎癥的作用機制，為臨床應(yīng)用根皮素防治各種炎癥性疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7細胞購自美國克拉克生物科學(xué)公司，并穩(wěn)定傳代4次；根皮素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；DMEM、胎牛血清（克拉克生物科學(xué)公司，美國）；胰蛋白酶（eBioscience公司，美國）；TRIzo（lInvitrogen公司，美國）；DMSO（百靈威科技有限公司，中國北京）；Taq酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、NP40蛋白裂解液、CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海）；Tween-20、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、HRP標記的二抗（碧云天）；COX-2、iNOS、p-IκBα、IκBα、p-NF-κBP65、NF-κB P65、p-Akt、Akt、p-P38、P38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、β-Tubulin一抗（圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國）；ELISA試劑盒、ECL超敏發(fā)光液（阿普利根生物技術(shù)研究所，中國北京）；免疫固定液、DAPI（北京生物技術(shù)公司，中國北京）；山羊抗兔二抗（圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國）；電泳儀（百晶生物技術(shù)有限公司，中國）；酶標儀、實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；熒光顯微鏡（蘇州曼威斯光學(xué)儀器有限公司，中國）；高壓滅菌鍋（Systec公司，德國）；低溫離心機（Sigma公司，德國）；實驗用烘箱（普斯特檢測設(shè)備公司，東莞）；標準恒溫搖床（丙林電子科技公司，上海）；pH計（中儀物聯(lián)技術(shù)公司，武漢）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 DMSO配制根皮素原液，濃度為12 mg/ml，加入培養(yǎng)基依次稀釋至實驗所需濃度，即分別取原液10μl，加5 990μl培養(yǎng)基，原液10μl，加3 990μl培養(yǎng)基，原液10μl，加2 990μl培養(yǎng)基，稀釋至20、30和40μg/ml。藥液中DMSO的總含量均不高于0.5%。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 從液氮中取出RAW264.7巨噬細胞迅速復(fù)蘇后，將其加入胎牛血清：DMEM=1：9的完全培養(yǎng)基中，并置于恒溫CO2培養(yǎng)箱，待細胞完全貼壁且生長至80%時，胰酶消化，然后以1：3比例傳代培養(yǎng)，待細胞完全貼壁且生長至80%時用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組及干預(yù) 將細胞分為正常組、模型組（LPS組）、根皮素低、中、高劑量組（根皮素20、30、40μg/ml組），除正常組外均構(gòu)建炎癥模型，即在含根皮素藥物干預(yù)前，將完全培養(yǎng)基吸出，加入不含胎牛血清（非完全培養(yǎng)基）的培養(yǎng)基進行24 h的饑餓處理，之后每個皿加入2μl LPS，培養(yǎng)箱中孵育4 h，密切觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 CCK-8法檢測RAW264.7的細胞活性 在CCK-8實驗中，經(jīng)3次傳代，待細胞穩(wěn)定后，將6×103個細胞用移液器加入96孔板（200μ/l孔），保證每孔細胞均勻，數(shù)量基本相同。將細胞恒溫培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)其增長到80%時，將完全培養(yǎng)基吸出，加入非完全培養(yǎng)基，200μ/l孔培養(yǎng)3 h，然后用不同濃度的根皮素（1、5、10、20、40、60、80、100μg/ml）處理細胞并孵育4 h，加入20μl CCK-8后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標儀測量450 nm處吸光度A。

1.2.5 ELISA測定細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β含量 分組同前，培養(yǎng)至細胞密度達80%后，吸出完全培養(yǎng)基，加入非完全培養(yǎng)基饑餓細胞，24 h后在根皮素低、中、高濃度組中分別加入相應(yīng)濃度的根皮素藥液，培養(yǎng)4 h后在除正常組之外的其余各組分別加入2μl 1μg/ml的LPS，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后將培養(yǎng)皿中的上清液移入EP管中備用。將上清液分別加入96孔板中后檢測相關(guān)基因表達。

1.2.6 RT-PCR檢測RAW264.7細胞中COX-2、iN‐OS、TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達 TRIzol試劑提取細胞總RNA，在primescript?第一鏈cDNA合成試劑盒的作用下，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參。在cfx96系統(tǒng)中，進行基因表達的PCR分析。95℃ 變性15 s，60℃ 退火40 s，72℃ 延伸15 s，擴增40個周期。采用2-ΔΔCt法分析。引物序列如表1。

1.2.7 Western blot測定根皮素作用于RAW264.7細胞后相關(guān)蛋白的表達 將RAW264.7巨噬細胞置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d。當(dāng)細胞增長至培養(yǎng)皿低壁80%時，用非完全培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基，饑餓細胞24 h，加入相應(yīng)濃度的根皮素，4 h后加入LPS，3 h后收集細胞，加入NP40裂解液，冰上裂解20 min，BCA試劑盒測蛋白濃度。將NP40、十二烷基硫酸鈉（5×SDS）、蛋白樣品按計算值加入EP管，沸水中煮5 min后，加入15μl樣品于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用5%脫脂乳TBST膜孵育2 h。將膜置于COX-2（1：1 000）、iNOS（1：1 000）、p-IκBα（1：2 000）、IκBα（1：2 000）、p-NF-κB P65（1：3 000）、NF-κB P65（1：2 000）、p-Akt（1：3 000）、Akt（1：3 000）、p-P38（1：1 000）、P38（1：1 000）、p-ERK1/2（1：2 000）、ERK1/2（1：2 000）、p-JNK1/2（1：1 500）、JNK1/2（1：1 500）和β-Tubulin（1：3 000）抗體中，4°C過夜，TBST中洗滌5次（10 min/次），然后在含山羊抗兔（1：3 000）或山羊抗鼠（1：3 000）二級抗體的5%的脫脂乳中孵育1 h，然后在TBST中再次洗滌5次，10 min/次，在暗室用ECL超敏發(fā)光液觀察條帶。

1.2.8 免疫熒光法檢測NF-κB P65在RAW264.7細胞中的核移位 將玻片放入濃硫酸中浸泡24 h，取出后流水沖洗30次，放入無水乙醇中浸泡4 h，蒸餾水沖洗10次，烘干后高壓滅菌，160℃烘箱3 h烤干，放入超凈臺備用。將玻片置于24孔板，事先準備好含有細胞懸液的培養(yǎng)基加入24孔板中爬片。待細胞完全貼壁且增長至40%～50%時吸出完全培養(yǎng)基，并加入非完全培養(yǎng)基饑餓細胞24 h，之后將除正常組外的每孔加入0.5μl的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h，低、中、高劑量組加入相應(yīng)濃度的根皮素，培養(yǎng)3 h后，每孔加入500μl冷PBS清洗3次（不含鉀），5 min/次。室溫下每孔加入免疫固定液500μl固定15 min，無鉀PBS清洗3次（5 min/次），擦干水痕，用含0.1%Triton X-100的PBS沖孔20 min（滲透）。再次用冷PBS清洗3次（不含鉀）。將24孔板中的玻片取出置于載玻片，每個玻片上加入50μl 5%山羊血清孵育3 h，沿邊緣擦干后，將200μl 5%山羊血清加入1μl NF-κBP65（1：200）抗體配成混合液，在每個玻片上加入混合液20μl孵育過夜。第2天室溫復(fù)溫30 min，清洗，擦干水痕，用山羊抗兔Ⅱ抗（1：2 000）放置1 h，在暗室操作。再次清洗后，DAPI固定細胞染色，靜置并在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果以±s表示，每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 根皮素對RAW264.7巨噬細胞生長抑制作用的影響 CCK-8法觀察細胞經(jīng)不同濃度的根皮素藥物處理后細胞增殖活性的變化，結(jié)果顯示，與正常組相比，各劑量藥物對RAW264.7巨噬細胞的增殖均無明顯影響（P＞0.05），表明在該濃度范圍內(nèi)，藥物不影響細胞增殖，亦沒有細胞毒性。見表2。

2.2 根皮素對RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響 ELISA結(jié)果表明，與正常組相比，模型組上述炎癥因子表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物濃度各劑量干預(yù)后可明顯下調(diào)細胞上清液中上述炎癥因子表達（P＜0.01或P＜0.001）。見表3。

2.3 根皮素對RAW264.7巨噬細胞相關(guān)COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響 與正常組相比，模型組mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預(yù)后各指標mRNA表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。見圖1、表4。

2.4 Western blot檢測根皮素對RAW264.7細胞的相關(guān)蛋白表達

2.4.1 根皮素對RAW264.7細胞MAPK信號通路的影響 與正常組相比，模型組MAPK信號通路的相關(guān)蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預(yù)后可明顯降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞p-P38和p-ERK1/2的蛋白表達水平（P＜0.01或P＜0.001），但對p-JNK1/2蛋白表達無影響。見圖2、表5。

表1 實時定量PCR引物Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR

表2 不同濃度根皮素對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響（xˉ ±s，n=5）Tab.2 Effect of phloretin at different concentrations on proliferation of RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=5）

表3 含根皮素藥物濃度對RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的影響（xˉ±s，n=3）Tab.3 Effect of phloretin concentration on TNF-α，IL-6 and IL-1βin RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=3）

表4 根皮素藥物各濃度對RAW264.7巨噬細胞相關(guān)mRNA表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.4 Effectsof different concentrationsof phloretin on expression of related mRNA in RAW264.7 macrophage（xˉ ±s，n=3）

圖1 RAW264.7巨噬細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達Fig.1 Protein expression electrophoresis of COX-2 and iNOSin RAW264.7 macrophages

圖2 RAW264.7巨噬細胞MAPK信號通路中P38、ERK 1/2、JNK1/2的蛋白表達電泳Fig.2 Protein expression electrophoresis of P38，ERK1/2，JNK 1/2 in MAPK signaling pathway of RAW264.7 macrophage

圖3 RAW264.7巨噬細胞Akt/NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白的表達電泳Fig.3 Expression and electrophoresis of related proteins in Akt/NF-κB signaling pathway of RAW264.7 mac?rophage

2.4.2 根皮素對RAW264.7巨噬細胞Akt和NF-κB信號通路的影響 與正常組相比，模型組Ak/t NF-κB信號通路的相關(guān)蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預(yù)后可明顯降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞Akt、IκBα、NF-κB P65的蛋白表達水平（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001）。見圖3、表6。

表5 根皮素藥物各濃度組對RAW264.7巨噬細胞MAPK信號通路蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.5 Effects of different concentrations of phloretin on MAPK signal pathway protein expression in RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=3）

圖4 顯示了NF-κB P65核移位的代表性顯微照片（×200）Fig.4 Representative micrographs showing nuclear translocation of NF-κB P65（×200）

表6 根皮素藥物各濃度組對RAW264.7巨噬細胞Akt/NF-κB信號通路蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.6 Effects of different concentrations of phloretin on Akt/NF-κB signaling protein expression in RAW264.7 macro?phages（xˉ ±s，n=3）

2.5 根皮素減弱LPS刺激的RAW264.7細胞NF-κB P65炎癥信號通路 Western blot和免疫細胞化學(xué)方法研究根皮素對RAW264.7巨噬細胞NF-κB P65磷酸化和NF-κB P65核移位的影響。Western blot結(jié)果表明，根皮素抑制NF-κB P65的磷酸化（圖3）。免疫細胞化學(xué)-免疫熒光（ICC-IF）結(jié)果表明，根皮素抑制NF-κBP65亞基向細胞核的轉(zhuǎn)移（圖4）。

3 討論

LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞分泌相關(guān)炎癥因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，因此，本實驗通過深入研究LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞抗炎細胞因子的變化規(guī)律，進一步認識其對炎癥反應(yīng)機制。LPS誘導(dǎo)細胞4 h，與正常組相比，模型組均可升高細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，表明炎癥模型造模成功。

TNF-α為一類經(jīng)典炎癥因子，可誘導(dǎo)多種炎癥的發(fā)生，最終導(dǎo)致細胞凋亡，并處于炎癥級聯(lián)反應(yīng)的中心，對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞NO合成具有重要意義。IL-1β是機體早期炎癥的標志物，可誘導(dǎo)炎癥因子IL-8等的產(chǎn)生，其產(chǎn)生在細胞損傷中起決定性作用［11-12］。促炎因子也包括IL-6，有研究表明，IL-6具有抗炎和致炎的雙向作用，其作用與其在組織中含量有關(guān)，正常水平的IL-6對機體有利，而過多IL-6會引起炎癥損傷，同時IL-6在神經(jīng)病理性疼痛中也發(fā)揮重要作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)根皮素低、中、高濃度組均可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的表達升高，并呈現(xiàn)良好的濃度依賴性，說明根皮素的抗炎作用與抑制炎癥細胞因子有關(guān)。

在炎癥反應(yīng)中，促炎癥酶（iNOS和COX-2）也起關(guān)鍵作用，其催化產(chǎn)物能顯著促進炎癥反應(yīng)進展，大量分泌NO，是炎癥反應(yīng)檢測的重要指標［15］。目前，調(diào)節(jié)NO合成酶及其誘導(dǎo)型合成酶iNOS的表達是治療炎癥疾病的重要手段。通常，組織細胞內(nèi)COX-2活性極低，在相關(guān)因素誘導(dǎo)后得到激活。通過調(diào)節(jié)前列腺素合成進而介導(dǎo)炎癥與疼痛反應(yīng)。因此，為了探討根皮素抗炎作用機制，課題組研究了LPS模型組和不同濃度根皮素組iNOS和COX-2的關(guān)系。本次研究結(jié)果表明，根皮素能顯著降低LPS刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生的iNOS和COX-2。這些研究表明，根皮素對RAW264.7細胞炎癥相關(guān)因子的表達具有抑制作用，并呈濃度依賴性。同時，HUANG等［16］的研究表明，根皮素能顯著抑制脂肪細胞慢性炎癥性疾病的炎癥反應(yīng)。

NF-κB是一類由P50和P65組成蛋白家族。其中P65是促炎基因表達的重要調(diào)節(jié)因子［17-18］。NF-κB通過控制TNF-α、IL-6和IL-1β的表達在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［19］。Akt是NF-κB的上游分子，對NF-κB的活化具有重要作用［20-21］。為了探討根皮素在炎癥反應(yīng)中的作用，課題組在LPS刺激的RAW264.7細胞中檢測了Ak/tNF-κB相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果表明，根皮素顯著減弱LPS誘導(dǎo)的Ak/t NF-κB相關(guān)蛋白的磷酸化。MAPK信號通路也參與炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)［22-23］。因此，課題組同時檢測了根皮素對P38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響。結(jié)果表明，根皮素能顯著下調(diào)ERK1/2和P38磷酸化。有研究表明，在急性肺損傷模型中，根皮素能顯著抑制JNK1/2的磷酸化［24］。該結(jié)果與本研究并不一致，因此課題組認為不同細胞的根皮素抑制炎癥的機制可能不同。

綜上，根皮素可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，其抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的生成，下調(diào)iNOS和COX-2蛋白表達，介導(dǎo)激活A(yù)k/tNF-κB、ERK1/2和P38蛋白表達的調(diào)控有關(guān)。這可能是其防治各種慢性炎癥疾病重要作用機制。為后續(xù)臨床開發(fā)用藥提供理論依據(jù)。