陳詠麗 董善武 蔣 姝 劉 娜 陶 雙

（武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院兒科，武漢430030）

支氣管哮喘是近年備受關(guān)注的全球公共衛(wèi)生問題，也是兒童最常見的慢性疾病，以氣道反應(yīng)性增強、氣道發(fā)炎和氣道重塑為特征［1］。近年來，兒童哮喘發(fā)病率呈升高趨勢，已嚴重影響兒童的健康和生長發(fā)育［2］。因此，對兒童哮喘的早期診斷和干預(yù)具有重要意義。近年研究顯示，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在哮喘的進展中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，靶向lncRNA是治療哮喘的新方向［3］。前列腺癌基因表達標(biāo)記物1（prostate can‐cer gene expression marker 1，PCGEM1）基因位于染色體2q32.3，研究顯示PCGEM1在前列腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)，干擾PCGEM1可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，是惡性腫瘤的潛在治療靶點［4-5］。對哮喘患者血清中差異性表達的lncRNA進行初步篩選發(fā)現(xiàn)，PCGEM1呈低表達，是臨床檢測哮喘潛在的新型分子標(biāo)記物［6］。支氣管上皮細胞是氣道抵抗外部環(huán)境的物理屏障，其功能障礙在哮喘的發(fā)病機制中起重要作用，但PCGEM1對哮喘患者支氣管上皮細胞增殖、凋亡的影響尚未見報道。因此，本研究以塵螨抗原浸出物刺激支氣管上皮細胞，通過檢測PCGEM1的表達及細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)變化，初步探討PCGEM1在支氣管哮喘中的作用，以期為支氣管哮喘的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞16HBE購于美國典型菌株保藏中心；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司；安脫達（塵螨抗原提取物）購于丹麥ALKAbello A/S公司；LipofectamineTM2000購于美國Invit‐rogen公司；小干擾RNA陰性對照（si-NC）、PCGEM1小干擾RNA（si-PCGEM1）、空載體（pcDNA3.1）、PC‐GEM1過表達載體（pcDNA3.1-PCGEM1）及PCR引物購于南京金斯瑞生物科技有限公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetra‐zolium，MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司；胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymostromal lymphocytin，TSLP）、ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；兔源Cyclin D1、P21、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leu‐kaemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceral‐dehyde dehydrogenase，GAPDH）抗體以及上樣抗兔Ⅱ抗為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組和處理 采用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、CO2體積分數(shù)5%。當(dāng)細胞生長融合度為90%時進行胰酶消化和傳代。取對數(shù)期16HBE進行實驗，將16HBE以1×105個/孔接種于6孔板，當(dāng)細胞生長融合度達到70%時，采用300 U/L安脫達刺激細胞24 h標(biāo)記為塵螨抗原浸出物［7］。正常培養(yǎng)的16HBE細胞標(biāo)記為對照組。為證實PCGEM1對塵螨抗原浸出物刺激支氣管上皮細胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000使 用 說 明 分 別 將si-NC、si-PCGEM1、pcD‐NA3.1、pcDNA3.1-PCGEM1轉(zhuǎn)染至16HBE，經(jīng)安脫達刺激24 h后，檢測細胞增殖、凋亡及炎癥因子分泌情況。

1.2.2 qRT-PCR檢測PCGEM1的表達水平 TRIzol法提取各組16HBE細胞的總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，并以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。PCGEM1上游引物序列為5′-CACGTGGAGGACTAAGGGTA-3′，下游引物序列為5′-TTGCAACAAGGGCATTTCAG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算PCGEM1的相對表達量。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 將16HBE以2×103個/孔接種于96孔板，按照1.2.1分組進行相應(yīng)細胞處理后，分別在24、48、72 h時間點向各孔加入20μl質(zhì)量分數(shù)為5 mg/ml的MTT試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去孔內(nèi)上清液，再向各孔加入150μl DMSO孵育2 h，當(dāng)結(jié)晶完全溶解后，全自動酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集按照1.2.1分組處理的各組細胞，PBS液洗滌細胞后，加入適量的結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度約為1×106個/ml，取100μl細胞懸液加入流式管，加入5μl Annexin V-FITC，輕輕地混勻后，室溫避光孵育10 min，加入5μl碘化丙啶（propidium iodide PI），室溫避光孵育5 min，補加結(jié)合緩沖液至500μl，輕輕混勻，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA檢測TSLP和TNF-α水平 16HBE按照1.2.1分組進行相應(yīng)處理后，分別收集各組細胞上清液，以3 000/rmin 4℃離心15 min，收集上清，參照ELISA試劑盒說明書檢測TSLP和TNF-α水平。

1.2.6 Western blot檢測Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2的蛋白表達 收集按照1.2.1分組處理的各組細胞，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度和純度。取適量細胞蛋白和等體積上樣緩沖液混合后，煮沸5 min使細胞蛋白充分變性。取30μg已冷卻至室溫的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白，結(jié)束后將蛋白濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶室溫條件封閉膜1 h，TBST洗膜后，加入已稀釋的Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，利用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯影，拍照后，以GAPDH為內(nèi)參照，圖像處理軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗分組均設(shè)置3個平行實驗或復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。所有實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示。采用t檢驗進行組間比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘過敏原作用于16HBE對細胞增殖、凋亡及炎癥因子表達的影響 見圖1、表1和表2，與對照組相比，塵螨抗原浸出物組16HBE在24、48、72 h細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，炎癥因子TNF-α和TSLP的表達顯著升高（P＜0.001）。

2.2 PCGEM1在塵螨抗原浸出物刺激的16HBE中的表達 與對照組（1.01±0.10）相比，塵螨抗原浸出物組（0.24±0.02）16HBE細胞PCGEM1的表達水平顯著降低（t=22.651，P＜0.001）。

圖1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on apoptosis

2.3 抑制PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影響 與si-NC組相比，si-PCGEM1組16HBE中的PCGEM1表達顯著降低，Cyclin D1表達水平顯著降低，P21的表達水平顯著升高，細胞在24、48、72 h細胞活力顯著降低（P＜0.001，圖2）。

2.4 抑制PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用于16HBE中凋亡及炎癥因子表達的影響 與si-NC組相比，si-PCGEM1組16HBE中Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，細胞上清液中TNF-α和TSLP表達顯著升高（P＜0.001）。見圖3、表3。

表2 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

表2 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）Control45.672±3.59427.182±2.685 Dust miteantigen extract144.582±12.5921）112.275±10.2721）t 22.66024.044 P 0.0000.000

圖2 抑制PCGEM 1對塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖蛋白表達的影響Fig.2 Effect of PCGEM 1 inhibition on expression of 16HBE proliferative protein by dust mite antigen extract

表1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對細胞增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表1 塵螨抗原浸出物作用于16HBE對細胞增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

Cell activity（490 nm）Apoptosis Groupsrate（%）24 h48 h72 h Control0.62±0.060.95±0.091.38±0.148.01±0.84 Dust mite antigen extract0.34±0.031）0.44±0.041）0.59±0.061）28.82±2.931）t 12.52215.53515.56020.482 P 0.0000.0000.0000.000

表3 抑制PCGEM 1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

表3 抑制PCGEM 1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with si-NCgroup，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosisrate（%）si-NC140.286±13.591113.511±11.2510.42±0.040.71±0.0728.11±2.82 si-PCGEM1178.110±16.2241）139.160±12.4281）0.71±0.071）0.35±0.031）34.12±3.511）t 5.3614.59010.79114.1814.004 P 0.0000.0000.0000.0000.000

表4 過表達PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an?tigen extract（±s，n=9）

表4 過表達PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an?tigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosis rate（%）pcDNA3.1142.275±13.599113.046±12.0460.43±0.040.74±0.0728.43±2.85 pcDNA3.1-PCGEM159.671±6.1241）36.511±3.6141）0.09±0.011）1.07±0.111）12.24±1.321）t 16.61618.25724.7397.59316.759 P 0.0000.0000.0000.0000.000

圖3 抑制PCGEM 1對塵螨抗原浸出物作用于16HBE凋亡及凋亡蛋白表達的影響Fig.3 Effect of PCGEM 1 inhibition on apoptosis and apoptosis protein expression of 16HBE by dust mite antigen extract

2.5 過表達PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcD‐NA3.1-PCGEM1組16HBE中的PCGEM1表達顯著升高，Cyclin D1表達水平顯著升高，P21表達水平顯著降低，細胞在24、48、72 h細胞活力顯著升高（P＜0.001，圖4）。

2.6 過表達PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎癥因子表達的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PCGEM1組16HBE中Bax蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，細胞上清液中TNF-α和TSLP表達顯著降低，（P＜0.001，圖5、表4）。

圖4 過表達PCGEM 1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE增殖蛋白表達的影響Fig.4 Effect of overexpressing PCGEM 1 on expression of 16HBE proliferative protein in role of dust mite an?tigen extract

圖5 過表達PCGEM1對塵螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及凋亡蛋白表達的影響Fig.5 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis and expression of apoptotic proteins in 16HBE in?duced by dust mite antigen extract

3 討論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的蛋白質(zhì)編碼能力有限的RNA，其可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)等多個水平調(diào)控生物過程。近年來，lncRNA在哮喘患者中的作用被逐漸揭示。例如，哮喘大鼠模型生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrestspecific 5，GAS5）的表達上調(diào)，GAS5通過miR-10a促進氣道平滑肌細胞增殖，敲除GAS5可顯著降低哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性［8］；靶向人漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移 基 因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）可控制重癥哮喘患者氣道平滑肌細胞增殖和炎癥因子釋放，有效減少氣道重塑，對哮喘患者具有積極意義［9］；外周血Treg和Th17細胞失衡的程度與哮喘癥狀的嚴重程度呈正相關(guān)，母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）通過調(diào)控哮喘患者Treg/Th17平衡進而緩解哮喘癥狀［10］。PC‐GEM1最早發(fā)現(xiàn)于前列腺癌，其在前列腺癌中表達上調(diào)，抑制PCGEM1可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)早期凋亡［11］。此外，PCGEM1在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中也發(fā)揮癌基因作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12-13］。但PCGEM1在支氣管哮喘中的作用并未闡明。

本研究以過敏原刺激支氣管上皮細胞，探討PCGEM1對支氣管上皮細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。氣道上皮細胞是抵抗病原體的天然屏障，當(dāng)其受到病原體或過敏原刺激后，支氣管上皮細胞產(chǎn)生TSLP等炎癥細胞因子，TSLP通過與其受體相互作用，激活局部樹突細胞，促進Th2免疫應(yīng)答炎癥反應(yīng)，進一步誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡，破壞上皮屏障的完整性［14-15］。TNF-α是支氣管哮喘研究中重要的檢測指標(biāo)，正常情況下可參與抗組織感染和炎癥反應(yīng)，但TNF-α的過度產(chǎn)生則促進炎癥細胞聚集，加劇氣管炎癥反應(yīng)［16］。本研究顯示，塵螨抗原浸出物刺激后支氣管上皮細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，炎癥因子TNF-α和TSLP表達顯著升高，PCGEM1表達水平顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制PCGEM1可促進TNF-α和TSLP分泌，促進P21和Bax蛋白表達，抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達，加劇塵螨抗原浸出物刺激對支氣管上皮細胞的增殖抑制和凋亡促進作用；而過表達PCGEM1則逆轉(zhuǎn)塵螨抗原浸出物刺激對支氣管上皮細胞的增殖、凋亡及TNF-α和TSLP分泌的影響。提示PCGEM1在支氣管哮喘進展中具有重要作用。然而，lncRNA調(diào)控通路復(fù)雜，PCGEM1下游是否存在miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是下一步研究重點［3］。

綜上所述，塵螨抗原浸出物刺激后支氣管上皮細胞中PCGEM1表達水平顯著下調(diào)，過表達PC‐GEM1可促進哮喘過敏原刺激條件下支氣管上皮細胞增殖，減少細胞凋亡，減輕炎癥，上調(diào)PCGEM1有望成為支氣管哮喘治療的新途徑。