桑玉玉 喻海忠

江蘇省南通市中醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001

乳腺癌在全球患病率、死亡率均較高[1]。研究表明每年全球乳腺癌新發(fā)確診病例約為130 萬，死亡人數(shù)約45 萬[2]。在歐美國家，乳腺癌在各類癌癥中的占比為25%～30%[3]。目前，我國乳腺癌患病率逐年增長，與此同時，其治療手段也逐漸增多，包括化療、放療、手術(shù)切除、生物細(xì)胞干預(yù)、靶向干預(yù)等，在一定程度上提升了遠期生存率。然而，即便如此，仍然有約33%的患者在5 年內(nèi)發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移，預(yù)后欠佳[4-5]。為了改善預(yù)后，臨床需采取措施及時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤，并進行干預(yù)，但現(xiàn)有技術(shù)針對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的檢出率較低。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）既往被用于乳腺癌化療效果評估中，其能反映癌癥進展情況[6-7]。人類表皮生長因子受體2（HER2）過表達已被證實能增強乳腺癌侵襲性，與其進展過程密切相關(guān)[8]。磷脂酰肌醇-3-激酶催（PI3K）信號通路在腫瘤進展中大多處于失調(diào)狀態(tài)，這可致通路功能發(fā)生變化，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]。本研究旨在分析CTC 與HER2、PI3KCA 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達意義，為該病診療提供依據(jù)，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取江蘇省南通市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2018 年4 月—2019 年6 月收治的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者50 例作為病例組，選取同期于我院體檢的健康婦女50 名作為正常組。病例組年齡36～85 歲，平均（56.90±10.03）歲；體重指數(shù)18～24 kg/m2，平均（21.01±0.84）kg/m2；病例類型：浸潤性導(dǎo)管癌34 例，非浸潤性導(dǎo)管癌16 例；內(nèi)臟轉(zhuǎn)移：有8 例，無42 例；轉(zhuǎn)移灶數(shù)量1～3 個，平均（1.82±0.46）個。正常組年齡34～86 歲，平均（58.67±9.92）歲；體重指數(shù)18～24 kg/m2，平均（21.12±0.79）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。研究方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①病例組均經(jīng)CT、MRI、病理穿刺證實為轉(zhuǎn)移性乳腺癌；②兩組均順利完成指標(biāo)檢測，臨床資料完整；③所有受試者均知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①存在出血傾向，或因慢性炎癥等引起的難愈合傷口；②伴其他原發(fā)性腫瘤或血液系統(tǒng)病、器質(zhì)性心臟疾??；③近3 個月內(nèi)存在放療、化療史；④合并嚴(yán)重感染。

1.3 方法

所有納入者分別于就診/體檢當(dāng)日采血測定各指標(biāo)，在空腹?fàn)顟B(tài)下，采集6 mL 肘靜脈血，分裝于3 個無菌試管內(nèi)，每管2 mL。①CTC 檢測：取2 mL 靜脈血，在空腹?fàn)顟B(tài)下采集。經(jīng)微流芯片法檢測CTC，檢測過程直接在芯片內(nèi)實現(xiàn)。首先，血樣進入芯片，取PBS沖洗液200 μL 對芯片予以沖洗。其次，取Triton x-100 PBS 液（濃度為0.2%）20 μL 加入芯片內(nèi)，反應(yīng)10 min，有助于細(xì)胞膜破裂。取清洗緩沖液200 μL 對芯片予以清洗，取20 μL 1%牛血清白蛋白對芯片進行處理，反應(yīng)10 min，行免疫熒光染色。經(jīng)倒置顯微鏡與配套軟件進行分析、觀察。②HER2 檢測：經(jīng)化學(xué)發(fā)光法測定HER2 蛋白，取2 mL 血樣，離心半徑16 cm，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，離心15 min，分離血清，化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒由北京百奧萊博科技有限公司提供（貨號：ZN2161-KCJ），嚴(yán)格根據(jù)說明書完成各項操作，并進行質(zhì)量控制。③CF-DNA 中PI3KCA 含量檢測：根據(jù)試劑說明書，使用德國QIAGEN 公司生產(chǎn)的Qiamp DNA 試劑盒（貨號：51504）分別從病例組和正常組血清中提取和純化游離DNA。同時，設(shè)計針對PI3KCA 短片段的上下游引物，序列如下，F(xiàn)w：5’-CTCCACGACCATCATCATCAGGT-3’，Rev：5’-TGGTTAT-TAATG-AGCCTCACGG-3’。將樣本置于7500 實時熒光儀托盤中，在95°C 90 s；40 個循環(huán)，95°C 15 s；54°C 45 s 的條件下擴增。將已知濃度的人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行梯度稀釋，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于推算樣品量。當(dāng)重復(fù)樣本之間的差異大于1 個周期閾值時，重復(fù)分析。在相同的8 個樣品上分別進行2 次實時實驗，以測試分析不精確性。然后計算PI3KCA 短片段的變異系數(shù)。④血清癌胚抗原（CEA）、糖類抗原15-3（CA15-3）：經(jīng)化學(xué)發(fā)光法測定，試劑盒由上海撫生實業(yè)有限公司提供（貨號：FS17620），根據(jù)說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)百分比（%）表示，采取χ2檢驗；經(jīng)Kappa 檢驗分析相關(guān)指標(biāo)診斷與病理診斷一致性；經(jīng)Pearson 線性模型分析CTC、HER2 蛋白量、CF-DNA 中的PI3KCA 含量與CEA、CA15-3 的相關(guān)性。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量表達比較

病例組CTC、HER2 以及CF-DNA 中PI3KCA CFDNA 含量均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量比較（）

表1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量比較（）

注：CTC：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；HER2：人類表皮生長因子受體2；PI3KCA：磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α

2.2 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量聯(lián)合診斷與病理診斷一致性分析

三者聯(lián)合診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌的靈敏度為86.00%，特異度為90.00%，準(zhǔn)確率為88.00%，陽性預(yù)測值為89.58%，陰性預(yù)測值為86.54%，與病理診斷一致性為0.760（高度一致）。見表2。

表2 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量聯(lián)合診斷與病理診斷一致性分析（例）

2.3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較

病例組血清CEA、CA15-3 含量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較（）

表3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較（）

注：CEA：癌胚抗原；CA15-3：糖類抗原15-3

2.4 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量與血清CEA、CA15-3 的相關(guān)性

Pearson 分析提示CTC 與血清CEA、CA15-3 呈正相關(guān)（r=0.752、0.801，均P <0.05）；HER2 與血清CEA、CA15-3 呈正相關(guān)（r=0.691、0.702，均P <0.05）；CF-DNA 中PI3KCA 含量與血清CEA、CA15-3 呈正相關(guān)（r=0.628、0.611，均P<0.05）。

3 討論

乳腺癌在女性癌癥患者中死亡率約達14%。雖然臨床針對該病的診療水平較過去明顯提升，但仍然有部分病例經(jīng)輔助干預(yù)后，病灶出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，演變成進展期乳腺癌，增加治療難度[10-12]。轉(zhuǎn)移性乳腺癌死亡率高，既往行常規(guī)MRI、CT 等檢查，雖然對病情診斷有一定價值，但無法了解治療靶點是否發(fā)生變化，難以為靶向干預(yù)提供依據(jù)[13]。因此，臨床需尋求有效指標(biāo)為其診療提供依據(jù)。

本研究顯示，與正常組比較，病例組的CTC、HER2以及CF-DNA 中PI3KCA 表達量明顯增高。CTC 是原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶脫落所致的一類細(xì)胞，可通過生物學(xué)行為進入血液內(nèi)[14]。研究表明癌癥患者在化療前，CTC 數(shù)量較多，其在外周血中處于較高表達水平，經(jīng)化療后，CTC 數(shù)量明顯減少[15]。另有研究認(rèn)為CTC 表達與癌癥患者預(yù)后密切相關(guān)，其表達越高，則生存率越低，表達越低，預(yù)后往往越好[16]。研究指出健康者未能檢測到CTC[17]。本研究則發(fā)現(xiàn)正常組中也檢出CTC，這可能是因操作過程中受客觀因素干擾所致，未來將對此進行更深入的論證。HER2 已被證實在乳腺癌患者中陽性率較高，且在病灶復(fù)發(fā)環(huán)節(jié)中，HER2 狀態(tài)發(fā)生明顯變化[18-20]。HER2 在血清中表達增高表明病灶具備更強侵襲性，其對化療效果具有一定預(yù)測價值[21]。有研究者針對乳腺癌患者進行研究，提示分期越高，HER2 在血清中表達程度越高[22]。這也證實HER2 表達與乳腺癌進展程度密切相關(guān)，對該病進展有較高評估價值。PI3K-AKT 信號通路激活對腫瘤細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，它與病灶侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。研究表明乳腺癌復(fù)發(fā)者的PI3K 陽性率高于非復(fù)發(fā)者[24]。此外，有學(xué)者證實PI3K-AKT 路徑激活可導(dǎo)致機體對化療藥物耐藥性的形成，影響療效[25]。在本研究中，筆者針對上述三項指標(biāo)進行分析，證實三者在轉(zhuǎn)移乳腺癌中表達增高，臨床需引起重視。

筆者發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合診斷時效果更顯著，與病理結(jié)果一致性較高。血清CEA、CA15-3 是評價惡性腫瘤的常用指標(biāo)，對腫瘤性質(zhì)鑒別有重要意義。研究表明乳腺癌患者血清CEA、CA15-3 含量能反映化療效果[26-28]。筆者發(fā)現(xiàn)與CTC、HER2、PI3KCA 與血清CEA、CA15-3含量均有相關(guān)性。因此，未來可根據(jù)CTC、HER2、PI3KCA表達的變化，推測血清CEA、CA15-3 含量的變化。

綜上，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的CTC、HER2、CF-DNA中PI3KCA 表達水平較正常者明顯增高，三者均能作為預(yù)測該病的重要指標(biāo)，與病理診斷一致性良好，與血清CEA、CA15-3 含量存在相關(guān)性。此外，本研究也有不足，如未分析三者對患者遠期預(yù)后的影響，未來將對此予以探討。