張 園 張世超

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)療設(shè)備處，遼寧沈陽(yáng) 110032

糖尿病是一種常見(jiàn)的臨床慢性代謝性疾病，其全球患病人數(shù)高達(dá)4.63 億，中國(guó)更是位居第一。高血壓作為糖尿病的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，同時(shí)也是2 型糖尿病發(fā)生心血管病變的重要危險(xiǎn)因素，其可加速損傷血管內(nèi)皮，加重病情。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中有40%～80%的患者同時(shí)并發(fā)高血壓[1]。西醫(yī)治療主要采用控制血糖、降低血壓等方法，雖有一定的療效，但長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致肝、腎功能損害。中醫(yī)藥具有整體觀、辨證論治的治療特點(diǎn)，應(yīng)用中藥治療本病具有很好的優(yōu)勢(shì)和療效。杞菊地黃丸作為經(jīng)典名方，具有滋腎養(yǎng)肝的作用，臨床多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，杞菊地黃丸治療本病可明顯改善患者血糖、血壓、血脂等指標(biāo)，降低胰島素抵抗[2-3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于多種大數(shù)據(jù)平臺(tái)及先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)的現(xiàn)代化研究方法，從宏觀到微觀科學(xué)地對(duì)抽象的中醫(yī)藥理論加以詮釋[4]，闡明中藥的有效性和科學(xué)性，使之與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相接軌。本研究擬基于此研究方法，預(yù)測(cè)杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的有效活性成分及作用靶點(diǎn)，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 杞菊地黃丸化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中分別以“枸杞子、菊花、澤瀉、熟地、山藥、茯苓、山茱萸、丹皮”為檢索詞，以“口服吸收率（OB≥30%），類藥性（DL≥0.18）和半衰期（HL≥4 h）”作為篩選條件，得到其有效的活性成分。在此基礎(chǔ)上通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得這些成分的Smiles 格式，同時(shí)應(yīng)用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），設(shè)置研究物種為人類（Homo sapiens），篩選Probability＞0 的靶點(diǎn)。采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，挖掘枸杞子、菊花、熟地、山茱萸、山藥、丹皮、茯苓、澤瀉八味中藥的作用靶點(diǎn)。

1.2 糖尿病合并高血壓靶點(diǎn)的篩選

以“糖尿?。╠iabetes）、高血壓（hypertension）”作為檢索詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.disgenet.org/）中分別搜索，合并去除重復(fù)和假陽(yáng)性值，獲得疾病靶點(diǎn)。

1.3 中藥-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用Venny 軟件將杞菊地黃丸中八味中藥的作用靶點(diǎn)與糖尿病合并高血壓的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，繪制韋恩圖，篩選出中藥與疾病的共有靶點(diǎn)。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，其中蛋白種類為人類“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，應(yīng)用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析，以節(jié)點(diǎn)度值分布（degree）和介數(shù)中心性（betweenness centrality）同時(shí)在中位數(shù)以上作為篩選條件，從而獲得核心靶點(diǎn)。degree 和betweenness centrality 值越大，證明節(jié)點(diǎn)越重要。

1.4 核心靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析

將中藥復(fù)方知柏地黃丸與六味地黃丸的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，設(shè)置物種為人類，對(duì)其進(jìn)行GO-BP 生物功能富集和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）Pathway 分析，從而進(jìn)一步比較中藥復(fù)方知柏地黃丸與六味地黃丸治療代謝綜合征在生物學(xué)功能及信號(hào)通路方面的差異性。Metascape 覆蓋范圍廣泛，包含了UniProt、NCBI、DrugBank 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，同時(shí)具有一定的時(shí)效性[9]。應(yīng)用Cytoscape 軟件構(gòu)建核心靶點(diǎn)-生物功能-代謝通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索杞菊地黃丸中八味中藥的活性成分及篩選，共收集到活性化合物枸杞子100 個(gè)。通過(guò)PubChem 及Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到杞菊地黃丸的作用靶點(diǎn)890 個(gè)。在GeneCards、TTD 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索、篩選，共獲得糖尿病靶點(diǎn)1267 個(gè)、高血壓靶點(diǎn)1352 個(gè)。通過(guò)Venny 軟件取交集后獲得杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓共有靶點(diǎn)138 個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)分析

應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建中藥與疾病共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。同時(shí)保存tsv 格式文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件，分析網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)（degree 和betweenness），篩選出degree≥6 和betweenness centrality≥5.69×10-3的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，共得到39 個(gè)核心靶點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT3）、磷脂酰肌醇激酶3（PIK3）、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）、絲氨酸/蘇氨酸激酶2（AKT2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）等。

圖2 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點(diǎn)生物功能和KEGG 通路富集分析

利用Metascape 軟件分別對(duì)篩選出的杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO-BP 生物學(xué)功能富集分析和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)杞菊地黃丸可通過(guò)血液循環(huán)、肽基絲氨酸磷酸化、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路等GO-BP 生物學(xué)功能發(fā)揮作用，見(jiàn)圖3。可通過(guò)VEGF 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、Toll 樣受體細(xì)胞信號(hào)通路等治療糖尿病合并高血壓，見(jiàn)圖4。以VEFG 為其主要通路，見(jiàn)圖5。利用Cytoscape軟件構(gòu)建核心靶點(diǎn)-GO-BP 生物功能-KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。

圖3 杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓GO-BP 生物學(xué)功能富集分析結(jié)果

圖4 杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓KEGG 通路富集分析結(jié)果

圖5 VEFG 信號(hào)通路

3 討論

糖尿病、高血壓在中醫(yī)學(xué)中多歸屬于“消渴”“眩暈”等疾病，糖尿病多以陰虛為本燥熱為標(biāo)，中醫(yī)多采用平肝潛陽(yáng)、益氣補(bǔ)腎等療法。杞菊地黃丸屬于中藥制劑，臨床上經(jīng)常用于治療糖尿病和高血壓等疾病。杞菊地黃丸出自清代董西園的《醫(yī)級(jí)·卷八》，是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上加枸杞子、菊花而成。方中枸杞子、山茱萸、山藥、熟地等可滋補(bǔ)腎陰，潛陽(yáng)育陰；菊花可疏風(fēng)平肝，清熱明目，茯苓、丹皮、澤瀉可健脾益氣，活血化瘀。全方合用，共奏滋陰潛陽(yáng)、補(bǔ)腎平肝之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子的主要活性成分為枸杞多糖、多酚等，可以刺激人體內(nèi)源性因子，提升抗氧化酶的活力[5]。菊花主要含黃酮類、揮發(fā)油等，通過(guò)增加肝細(xì)胞中的PPAR，從而降低血糖，并具有保護(hù)血管舒張反應(yīng)性、增強(qiáng)心肌收縮力的作用[6]。熟地中主要有多糖、5-羥甲基糠醛等，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫力的作用[7]。山藥中主要含有多糖、氨基酸、山藥素類化合物，可增加胰島素分泌，改善受損壞的胰島β細(xì)胞功能，從而降低血糖，亦可以降低血脂，調(diào)節(jié)免疫[8]。山茱萸中主要含有環(huán)烯醚萜、黃酮、多糖等，可降低血壓，調(diào)節(jié)糖、脂等代謝過(guò)程[9]。茯苓的主要藥效成分為三萜類和多糖類等化合物，具有抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝功能的作用[10]。丹皮中含有酚及酚苷類等化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的降糖及保護(hù)心血管等多種作用[11]。澤瀉主要含有糖類、三萜、倍半萜等，具有利尿、降血脂、降血糖及抗氧化損傷等作用[12]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)杞菊地黃丸的含有100 個(gè)活性化合物、890 個(gè)作用靶點(diǎn)，與糖尿病合并高血壓共有靶點(diǎn)138 個(gè)，驗(yàn)證了中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出核心靶點(diǎn)39 個(gè)，即STAT3、PIK3、PPAR、AKT2、VEGFA 等。STAT3 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，當(dāng)機(jī)體血糖和血壓值較高時(shí)，其表達(dá)增加[13]。STAT3 可激活VEGF 信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖[14-15]。PIK3R、AKT2 是構(gòu)成PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)杞菊地黃丸能夠上調(diào)PI3K、Akt 的表達(dá)[16]。PI3K/Akt 在機(jī)體高表達(dá)時(shí)，可以激活eNOS 和PPAR，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，從而起到保護(hù)血管的作用[17-18]。PPAR具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和胰島素抵抗的作用，其激活后可保護(hù)血管平滑肌和血管內(nèi)皮[19-20]。GO-BP 生物學(xué)功能富集分析和KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)杞菊地黃丸可通過(guò)血液循環(huán)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、肽基絲氨酸磷酸化等生物學(xué)功能及VEGF 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、Toll 樣受體細(xì)胞信號(hào)通路等發(fā)揮其治療糖尿病合并高血壓的作用。VEGF 是一種血管通透性因子，既可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，又可誘導(dǎo)血管增生，同時(shí)可調(diào)節(jié)血管的通透性，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、機(jī)體修復(fù)損傷等生物學(xué)過(guò)程[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病合并高血壓患者體內(nèi)，VEGF 含量明顯升高，且高于單純糖尿病患者和高血壓患者[23]。體內(nèi)VEGF 含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。ErbB 信號(hào)通路參與細(xì)胞的存活、增殖和其他生理反應(yīng)。國(guó)外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2 雙重靶向抑制劑雷帕替尼可通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的ErbBs 信號(hào)改變，從而阻止細(xì)胞凋亡和改善血管功能[24]。Toll 樣受體可使機(jī)體釋放大量炎性因子激活免疫炎癥反應(yīng)，參與胰島素抵抗、胰島細(xì)胞的炎癥反應(yīng)等過(guò)程，其在糖尿病合并高血壓的患者體內(nèi)表達(dá)增加[25]。

圖6 杞菊地黃丸核心靶點(diǎn)-GO-BP 生物功能-KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)圖

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的作用機(jī)制從多方面進(jìn)行了深度的挖掘，為進(jìn)一步闡明中藥對(duì)疾病的干預(yù)和影響及今后的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論指導(dǎo)和新的思路。