范玉宏 周海豐 范 爽 王立坤 侯雅雄 劉 博

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理教研室，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000；5.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北張家口 075000

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)食管癌發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)，2014 年我國(guó)居民食管癌新發(fā)病例數(shù)繼肺癌、胃癌、食管鱗癌、肝癌、乳腺癌之后位居第六，死亡例數(shù)繼肺癌、肝癌、胃癌位居第四，嚴(yán)重威脅國(guó)民健康安全[1-2]。我國(guó)食管癌90%以上為鱗癌，其早期篩查診斷、規(guī)范的治療方式和敏感的預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)于患者的無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）、總生存期（overall survival，OS）的提高，生活質(zhì)量的改善有著非常重要的影響[3]。因此，進(jìn)行與食管癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究，尤其是分子生物學(xué)研究，為臨床早期診斷提供準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物已成為臨床醫(yī)師的研究熱點(diǎn)。

早期研究證實(shí)，細(xì)胞CXCR2 主要影響骨髓來(lái)源單核細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和髓源性抑制性細(xì)胞分化和募集，進(jìn)而在炎癥誘導(dǎo)的惡性腫瘤發(fā)生中起重要作用；但近年發(fā)現(xiàn)，CXCR2 在肺癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌等人類(lèi)諸多惡性腫瘤中表達(dá)量增高，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致癌作用，但在食管鱗癌中的研究文獻(xiàn)極少[4-6]。GROα 是ELR+CXC 趨化因子，是CXCR2 的最強(qiáng)配體，表達(dá)與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并對(duì)中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化作用。研究證實(shí)，GROα 在肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)，但在食管鱗癌中的研究報(bào)道較少[7-9]。

本研究通過(guò)對(duì)食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CXCR2、GROα 行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫組織化學(xué)技術(shù)，旨在探討CXCR2、GROα 在食管鱗癌和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，同時(shí)收集患者的臨床資料，分析二者的表達(dá)水平和相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為食管鱗癌的早期篩查診斷、治療評(píng)估和預(yù)后監(jiān)測(cè)方面提供敏感度高、特異性強(qiáng)的分子標(biāo)志物，同時(shí)為食管鱗癌的精準(zhǔn)治療、靶向治療提供科研基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年1 月—2018 年6 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸心外科食管癌手術(shù)切除后病理確診為食管鱗癌的組織70 例，其中男38 例，女32 例；年齡39～78，平均（59.1±6.4）歲；正常組織70 例（切緣距離癌組織＞5 cm，且經(jīng)病理證實(shí)為正常組織），同時(shí)收集患者完整的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理證實(shí)為食管鱗癌，未接受化學(xué)治療、生物治療及放射治療等，臨床資料完整；排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合食管鱗癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者，臨床資料不全或難以配合取材者，合并嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者。本研究經(jīng)患者及家屬知情同意，醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑和儀器 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：639505）、RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：3735A）、PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒（貨號(hào)：3733）均購(gòu)自日本Takara 公司；CXCR2、GROα 和β-catenin 引物由上海生工有限公司設(shè)計(jì)合成，全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（E2010）購(gòu)自瑞士羅氏公司，DEPC 水購(gòu)自美國(guó)sima 公司，兔抗人CXCR2 單克隆抗體（貨號(hào)：EPR22301-103）、兔抗人GROα 多克隆抗體（貨號(hào)：EPR21759-11）均購(gòu)自美國(guó)ABCAM 公司，DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉公司。

1.2.2 qRT-PCR 取食管癌組織及癌旁正常組織各5 mg，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取癌組織和癌旁組織的總mRNA，測(cè)定總mRNA 濃度。取4 μL mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：25℃5 min，42℃15 min，85℃5 s。取2 μL cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增引物：CXCR2 正向引物：5’-ATTCTGGGCATCCTTCACAG-3’，反向引物：5’-TGCACTTAGGCAGGAGGTCT-3’；GROα 正向引物：5’-CCGAAGTCATAGCCACACTCAA-3’，反向引物：5’-TGTTGCAGGCTCCTCAGAAATA-3’；GAPDH 作為內(nèi)參，正向引物：5’-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3’，反向引物：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3’。反應(yīng)條件為：95℃1 min 預(yù)變性，1 個(gè)循環(huán)，94℃20 s 變性，55℃30 s 退火，72℃30 s延伸，5 個(gè)循環(huán)，94℃15 s，60℃30 s 收集熒光，40 個(gè)循環(huán)，采用ΔΔCt 相對(duì)定量法分析結(jié)果，差異水平用2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct管家基因）。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法 將癌組織標(biāo)本連續(xù)切片4 μm貼附于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中CXCR2、GROα 蛋白的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5 個(gè)高倍視野（400×）。CXCR2、GROα 蛋白陽(yáng)性均主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image J 觀察分析抽取結(jié)果，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值和陽(yáng)性面積百分比，給出4 種評(píng)分：3 分（強(qiáng)陽(yáng)性）、2 分（陽(yáng)性）、1 分（弱陽(yáng)性）、0 分（陰性）；分別對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分，兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終評(píng)分，總積分＜3 分為陰性，總積分＞3 分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；qRT-PCR 結(jié)果用GraphPad Prism5 軟件進(jìn)行分析和作圖；CXCR2 和GROα 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性用Spearman 檢驗(yàn)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

食管鱗癌和癌旁正常組織中CXCR2 mRNA、GROα mRNA 表達(dá)：以目的基因與GAPDH 的比值作為qRT-PCR 相對(duì)定量分析結(jié)果，癌組織中CXCR2 mRNA、GROα mRNA 的表達(dá)水平明顯高于正常食管組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（）

表1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（）

注：CXCR2：趨化因子受體2；GROα：生長(zhǎng)調(diào)節(jié)性基因α

2.2 食管鱗癌和癌旁正常組織中CXCR2 和GROα蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示癌組織中CXCR2 陽(yáng)性表達(dá)為84.29%（59/70），明顯高于其在正常組織中的37.14%（26/70），癌組織中GROα 陽(yáng)性表達(dá)為72.86%（51/70），明顯高于其在正常組織中的32.86%（23/70），差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.441、16.508，均P ＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)CXCR2、GROα 在正常食管組織和癌組織中的表達(dá)情況(SP，400×)

2.3 CXCR2 和GROα 蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

CXCR2 和GROα 蛋白表達(dá)均與腫瘤的分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P ＜0.05），而與腫瘤大小無(wú)關(guān)（P ＞0.05），TNM 分期越高，二者的表達(dá)水平越高，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的患者二者的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者（均P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 CXCR2 和GROα 蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 食管鱗癌組織中CXCR2 和GROα 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 檢驗(yàn)結(jié)果顯示CXCR2 和GROα 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.476，P ＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 食管鱗癌組織中GROα 和CXCR2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

趨化因子受體可參與病原體的清除、炎癥反應(yīng)、病原體感染、細(xì)胞及器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的修復(fù)等病理生理過(guò)程，而且其與相應(yīng)的配體結(jié)合能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)。目前，已有相關(guān)研究表明趨化因子與腫瘤的形成及其轉(zhuǎn)移相關(guān)，多種趨化因子均與腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的相應(yīng)受體有關(guān)[10]。

CXCR2 是趨化因子受體家族中的重要一員，最早由Holmes 和Murphy 克隆成功，CXCR2 基因定位于人染色體2q35 上，內(nèi)含2 個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子。CXCR2 蛋白全長(zhǎng)約為350 個(gè)氨基酸，由1 個(gè)糖基化的N 末端和7 個(gè)富含疏水氨基酸跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)組成[11]。CXCR2 是一種7 次跨膜的G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），其在細(xì)胞內(nèi)、外各有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，每一個(gè)位于胞外的結(jié)構(gòu)域均含有一個(gè)特定的半胱氨基酸殘基，而其中的一個(gè)N 末端結(jié)構(gòu)域與配體的結(jié)合有關(guān)。由α、β 和γ3個(gè)亞基構(gòu)成的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)，CXCR2 完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需依靠這種偶聯(lián)的G 蛋白[12-13]。

GRO 家族共3 個(gè)成員，GROα（CXCL1）、GROβ（CXCL2）和GROγ（CXCL3），其受體均為CXCR2，其中以GROα 與CXCR2 結(jié)合最強(qiáng)。GROα 基因定位于人染色體4q21，由3 個(gè)內(nèi)含子和4 個(gè)外顯子構(gòu)成。GROα cDNA 編碼73 個(gè)氨基酸，其效應(yīng)與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)[14]。GROα 與其受體CXCR2 結(jié)合后，參與機(jī)體炎癥、感染、創(chuàng)傷愈合等病理過(guò)程，此外，還能誘導(dǎo)在腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)。具體機(jī)制為：①直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移；②促進(jìn)腫瘤血管形成、白細(xì)胞浸潤(rùn)，為腫瘤的形成和發(fā)展提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。

Xiang 等[16]研究證實(shí)，在胃癌組織中CXCR2 和GROα 蛋白的表達(dá)顯著高于正常組織，且與胃癌的浸潤(rùn)程度、大小、TNM 分期、淋巴結(jié)和神經(jīng)浸潤(rùn)均有關(guān)，生存期研究顯示二者的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)。Kasashima 等[17]研究證實(shí)，癌細(xì)胞中的GROα通過(guò)CXCR2 信號(hào)刺激了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（BM-MC）向腫瘤基質(zhì)的募集，癌細(xì)胞中GROα 的表達(dá)與T 細(xì)胞侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴侵襲、靜脈侵襲、腹膜轉(zhuǎn)移及間質(zhì)細(xì)胞CXCR2 表達(dá)相關(guān)。CXCR2 在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與組織學(xué)類(lèi)型、T 細(xì)胞侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴侵襲、浸潤(rùn)、腹膜轉(zhuǎn)移和CD271 在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)。GROα 和CXCR2 陽(yáng)性癌癥患者的總體生存率較陰性癌癥患者低。胃癌細(xì)胞中GROα 表達(dá)和基質(zhì)細(xì)胞中CXCR2 表達(dá)都是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。Yung等[18]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)GRO-α 可通過(guò)CXCR2 受體激活TAK1/NFκB 信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)shRNA 基因敲低、CXCR2 抑制劑SB225002 等方法處理，卵巢癌細(xì)胞中TAK1/NFκB 信號(hào)傳導(dǎo)顯著減弱，并降低體內(nèi)外致癌和轉(zhuǎn)移的潛力，表明CXCR2 在GRO-α 控制的腹膜腔卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起關(guān)鍵作用。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了GRO-α 在腹膜腫瘤微環(huán)境中作為關(guān)鍵趨化因子的重要性，并建議將受體CXCR2 作為卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移的潛在治療靶標(biāo)。Li 等[19]在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)，GROα-CXCR2 軸能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，而阻斷GROα-CXCR2 軸，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

本研究顯示，CXCR2 和GROα 在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于正常食管組織，提示食管黏膜在癌變的過(guò)程中，CXCR2 和GROα 相互作用，啟動(dòng)趨化過(guò)程，從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生；進(jìn)一步研究顯示，在食管鱗癌中CXCR2 和GROα 表達(dá)水平與其分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)，且二者表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示CXCR2 和GROα 相互結(jié)合，共同參與整個(gè)趨化過(guò)程，二者表達(dá)越高，病變?cè)絿?yán)重、預(yù)后越差。有研究證實(shí)[20-22]，CXCR2 和GROα 結(jié)合后能激活機(jī)體腫瘤細(xì)胞內(nèi)包括RAS、MAPK、AKT、NF-KB 等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，同時(shí)誘導(dǎo)多種腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMMP）-2、MMP-9 等，因而在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23-25]。

綜上，CXCR2 和GROα 的異常表達(dá)和食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其具體的相互作用機(jī)制及相關(guān)通路需要進(jìn)一步研究，這也將是本研究下一步努力的方向。