肖 瑤 曹曄文 李 菲 晏蔚田 李 俊 魏軍平

1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029

Graves 眼?。℅O）是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，占Craves ?。℅D）的25%～50%[1]，具有眼球突出、活動受限、瞼裂增寬、眼瞼水腫等表現(xiàn)。目前GO 西醫(yī)治療效果欠佳，副作用大，中醫(yī)藥治療對突眼度、病情活動性評分的改善有一定作用[2]。GO 中醫(yī)病位在目，與肝密切相關(guān)，多數(shù)醫(yī)家認為肝火旺盛為GO的主證[3]。夏枯草有清肝明目、消腫散結(jié)等功效，且具有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗炎[5]等作用，在治療甲狀腺結(jié)節(jié)、GD等方面具有良好效果[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于疾病、靶點、藥物間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，是分析研究某中藥或復(fù)方潛在活性成分和作用靶點的新方法[7]，可加速對藥物靶點的發(fā)現(xiàn)，提高新藥研發(fā)效率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用[8]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討夏枯草對GO 的作用機制。

1 資料與方法

1.1 夏枯草主要活性成分及作用靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[9]尋找夏枯草活性成分，并根據(jù)已發(fā)表文獻進行其他活性成分及靶點的補充。以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為標準初篩，并進行靶點預(yù)測，通過Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）進行信息標準化。

1.2 GO 相關(guān)靶點篩選

因數(shù)據(jù)庫存在更新周期較久的情況，單獨某個數(shù)據(jù)庫無法完全納入相關(guān)靶點，故本研究以“Graves’ophthalmopathy”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org）中GO 相關(guān)靶點，并進行文獻檢索補充。將得到的疾病靶點合并去重，得出GO 相關(guān)靶點。

1.3 構(gòu)建夏枯草-GO 靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將夏枯草與GO 相關(guān)靶點取交集后，提交至STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）[10]，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。每個節(jié)點代表一個單一蛋白編碼基因位點產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)，相互作用線段代表蛋白質(zhì)的相互結(jié)合，介度為網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的連線數(shù)。通過CytoScape 3.6.1 進一步處理分析，明確關(guān)鍵靶點。

1.4 夏枯草-GO 靶點KEGG 信號通路與基因本體功能富集分析

將交集靶點錄入Metascape 平臺[11]（http：//metascape.org/gp/index.html），以富集數(shù)量≥3、P <0.01 為標準進行KEGG 信號通路與基因本體功能富集分析。

1.5 藥物-成分-疾病-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用Cytoscape 構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件內(nèi)置功能分析其介度等網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，將其由高致低排序，得出核心靶點及主要活性成分。

1.6 分子對接驗證

根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)介度排序得出的最主要活性成分及前4 個核心靶點進行分子對接驗證。于PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu)文件，運用Pymol 軟件去除水分子和配體分子，利用AutoDock Tools 軟件將配體、受體的三維結(jié)構(gòu)進一步處理，并使用AutoDock Vina軟件[12]進行分子對接，得出Full Fitness 值。靶點蛋白與活性成分親和力越好，F(xiàn)ull Fitness 值越低，進而驗證其結(jié)合的緊密程度。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草主要活性成分及作用靶點獲取

初步提取并篩選后獲得11 個夏枯草有效活性成分（表1）和200 個活性成分相關(guān)靶點。

表1 夏枯草主要活性成分

2.2 GO 相關(guān)靶點的獲取

從GeneCards、OMIM、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫分別獲得GO 相關(guān)靶點294、19、7 個，查閱文獻獲得靶點2 個，合并、去重后得到314 個GO 相關(guān)靶點。

2.3 夏枯草-GO 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

得到交集靶點48 個并于STRING 數(shù)據(jù)庫獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共282 條相互作用線段，平均介度值為11.8。進行Cytoscape 處理后，得到圖1 所示網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點圓圈越大說明越重要，線條越粗說明相互作用越強。

圖1 夏枯草-Graves 眼病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG 信號通路富集結(jié)果

運用Metascape 數(shù)據(jù)庫得到195 條信號通路，篩選前20 條最具有代表性的信號通路（表2），并繪制氣泡圖（圖2）。其中，腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、核因子-κB（NF-κB）信號通路和磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路等與GO 密切相關(guān)。

圖2 KEGG 通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG 通路富集分析結(jié)果

2.5 基因本體功能富集分析結(jié)果

通過基因本體功能分析，得到生物過程（BP）條目1456 個，細胞組成（CC）條目27 個，分子功能（MF）條目52 個。分別選取P 值最小的前10 個條目進行可視化處理（圖3）。可知交集靶點對于細胞黏附的調(diào)控、白細胞分化、細胞增殖的負調(diào)控等生物過程具有一定影響，可能參與分泌顆粒管腔、胞質(zhì)小泡腔、水泡腔等細胞組成，與受體配體活性、受體調(diào)節(jié)活性、細胞因子受體結(jié)合等分子功能方面相關(guān)。

2.6 藥物-成分-疾病-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），粉色為疾病名稱，綠色為活性成分，紫色為中藥，黃色為交集靶點，藍色為通路。節(jié)點大小與介度值呈正相關(guān)。

2.7 分子對接驗證

選擇槲皮素與4 個核心靶點進行分子對接驗證（圖5），其結(jié)合緊密程度較高的靶點依次為血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、白介素6（IL-6）、TNF、白介素1β（IL-1β），F(xiàn)ull Fitness 值分別依次為-7.4、-7.1、-6.8、-5.4，說明槲皮素與VEGFA、IL-6 等的相互作用可能在夏枯草治療GO 過程中發(fā)揮主要作用。

3 討論

通過研究，槲皮素、木犀草素、山奈酚等可能為夏枯草治療GO 的主要有效成分。槲皮素對治療GO 活動性炎癥和慢性纖維化具有潛在用途[13]，可能與其降低活性氧抑制脂肪生成、減輕球后脂肪增厚相關(guān)[14]。木犀草素可抑制自身免疫性甲狀腺炎（AITD）小鼠早期甲狀腺內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）1 和STAT3 的表達，減輕單核細胞浸潤和甲狀腺上皮細胞破壞[15]。山奈酚可增強編碼甲狀腺激素激活的2 型脫碘酶活性，增加三碘酪氨酸的活化[16]。

夏枯草治療GO 的可能核心靶點主要包括IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、細胞間黏附分子1（ICAM1）等。急性期治療前GO 患者外周血IL-6 和TNF 水平均明顯高于治療后及慢性緩解期GO 患者[17]。GO 的發(fā)病和持續(xù)依賴于TNF-α 等細胞因子的誘導(dǎo)，進而活化單核細胞、血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞表面的黏附分子[18]。TNF、IL-6 等共同作用可引起淋巴細胞浸潤及B細胞激活，產(chǎn)生甲狀腺自身抗體，引起AITD[19]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠甲狀腺發(fā)育需要內(nèi)皮細胞分泌VEGFA，使內(nèi)皮細胞吸收和擴張[20]。此外，GO 的易感基因型與血漿IL-1β 水平降低有關(guān)[21]。而體外實驗發(fā)現(xiàn)，IL-1β 誘導(dǎo)球后成纖維細胞表達的趨化因子RANTES 參與GO眶后淋巴細胞浸潤[22]。GO 活動期患者血清ICAM1水平顯著高于對照組，經(jīng)激素治療后，其水平較治療前顯著降低[23]。

圖3 基因本體功能富集分析圖

圖5 分子對接結(jié)果

在KEGG 通路富集分析方面，除了與核心靶點密切相關(guān)的TNF 信號通路外，NF-κB1 基因啟動子區(qū)域插入/缺失（-94ins/delATTG）的基因多態(tài)性與GO 的發(fā)展及發(fā)病年齡相關(guān)[24]。此外，抑制PI3K 信號可能為GO 的一種新的治療途徑，其與一種可促進GO 患者眼眶成纖維細胞脂肪生成的促甲狀腺激素受體人單克隆抗體M22 可能具有聯(lián)級作用[25]。

綜上，槲皮素可能為夏枯草干預(yù)GO 的最主要有效成分，IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β 可能為最主要的作用靶點。夏枯草主要通過TNF 信號通路、NF-κB 信號通路及PI3K-Akt 信號通路對免疫和炎癥反應(yīng)等方面產(chǎn)生影響，進而對GO 的治療發(fā)揮作用。