張永紅，邵榆嵐，蘇振國(guó)，白興榮

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】絲氨酸蛋白酶(Serine protease，SP)是一類以絲氨酸為催化中心的蛋白質(zhì)水解酶基因家族，在昆蟲體內(nèi)參與了食物消化、發(fā)育、先天免疫等[1-3]。家蠶絲氨酸蛋白酶基因家族包括BmSP(Bombyxmoriserine protease，BmSP)和同源體BmSPH(Bombyxmoriserine protease homolog，BmSPH)[4]，它們是家蠶先天免疫通路中調(diào)控級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵酶類[5]，所以研究BmSPs基因在家蠶免疫應(yīng)答方面的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】絲氨酸蛋白酶(SPs)普遍存在于生物體中，是一類含有保守催化三聯(lián)殘基His、Asp和Ser的蛋白質(zhì)水解酶[6]，它們通常以非酶催化活性的前體存在，其前肽必須被修剪才能激活，趙萍等[7]在家蠶基因組中共鑒定到143個(gè)BmSPs基因，分別標(biāo)記為BmSP1—BmSP143，其中包括51個(gè)BmSPs和94個(gè)BmSPHs。BmSPs基因在家蠶體內(nèi)組織和時(shí)期表達(dá)量不同，進(jìn)而發(fā)揮著不同的功能[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)BmSPs基因家族成員中BmSP2作為中腸消化酶，對(duì)家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)具有免疫作用[9]，且BmSP25基因在BmNPV的感染誘導(dǎo)下產(chǎn)生了免疫響應(yīng)[10]、BmSP142在家蠶感染BmNPV與BmBDV(Bombyxmoribidensovirus，BmBDV)后均表現(xiàn)為上調(diào)[11]，BmSP36與BmSP141參與家蠶的食物消化過程[12-13]、BmSP95在家蠶蛹皮蛻化過程中發(fā)揮著功能[14]。絲氨酸蛋白酶同源物(SPHs)在氨基酸序列上與SPs相似，但由于一個(gè)或多個(gè)催化殘基發(fā)生突變而缺乏酶催化活性[15]，但它們參與了前酚氧化酶(proPO)激活系統(tǒng)，導(dǎo)致黑色素化。研究發(fā)現(xiàn)家蠶絲氨酸蛋白酶同源體BmSPH-1具有幼蟲-蛹轉(zhuǎn)化、蛹表皮黑色素化和家蠶天然免疫的雙重作用[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】家蠶絲氨酸蛋白酶BmSPs在家蠶腸道內(nèi)主要參與食物消化，還參與宿主的免疫應(yīng)答過程，至今未見BmSPH33基因?qū)mNPV免疫響應(yīng)機(jī)理方面的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】獲得BmSPH33基因序列并結(jié)合其轉(zhuǎn)錄情況，另外家蠶感染BmNPV后該基因表達(dá)模式明確誘導(dǎo)響應(yīng)機(jī)理，為弄清BmSPH33基因在參與家蠶先天免疫方面發(fā)揮作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試家蠶品種為大造(P50)，純化后的BmNPV病毒粒子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所保存。TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品：RNAiSo Plus Total RNA提取試劑盒、One Step RNA PCR Kit (AMV)與PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Mixture、SYBR Primix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) qRT-PCR試劑盒；生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品：PCR引物、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶組織樣品收集 家蠶大造(P50)品種幼蟲在27 ℃條件下用新鮮桑葉飼養(yǎng)至5齡第3天，解剖幼蟲并收集頭部、血液、體壁、中腸、脂肪體、絲腺、精巢和卵巢；BmNPV添毒實(shí)驗(yàn)中，正常飼育的5齡起蠶平均分為2組，其中一組按照BmNPV多角體懸浮液5.13×107PIB·mL-1的濃度喂食家蠶10 μl·頭-1；另外一組同樣喂食10 μl ddH2O。兩組家蠶添食后常規(guī)桑葉飼養(yǎng)。在不同時(shí)間4、8、12、24和48 h分別解剖家蠶并收集中腸樣品，其中添食ddH2O家蠶的中腸樣品為對(duì)照。

1.2.2 BmSPH33序列分析 登錄家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SilkwormDB，獲取BmSPH33基因ORF序列，利用生物學(xué)在線軟件對(duì)BmSPH33蛋白的分子量、等電點(diǎn)、信號(hào)肽、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),其中理論等電點(diǎn)與分子量預(yù)測(cè)軟件ExPASy(http://web.expasy.org/)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件SignalP v5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能結(jié)構(gòu)域軟件CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、二級(jí)結(jié)構(gòu)軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件SWISS-MODLE(https://swissmodel.expasy.org/)；利用MEGA5.0軟件對(duì)BmSPH33與其它物種SPH33序列生成.fasta與.mega文件，結(jié)合GeneDoc軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；根據(jù)MEGA5.0 中Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[17]。

1.2.3 家蠶組織樣品總RNA提取及cDNA合成 利用液氮將家蠶不同組織樣品和不同時(shí)期處理的中腸樣品充分研磨，按照RNAiSo Plus Total RNA提取試劑盒操作步驟抽提RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA樣品濃度和純度，將抽提的RNA根據(jù)One Step RNA PCR Kit (AMV)說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4 家蠶不同組織BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄情況 設(shè)計(jì)BmSPH33基因RT-PCR引物(表1)。以家蠶肌動(dòng)蛋白基因Bmactin3為內(nèi)參基因，家蠶不同組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μl：10×PCR buffer(Mg2+plus) 2.5 μl，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μl，5 U·μl-1r-Taq聚合酶 0.25 μl，10 μmol·L-1上下游引物 0.5 μl，cDNA模板0.5 μl，ddH2O補(bǔ)齊25 μl；反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；(94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)× 30 cycles；72 ℃ 10 min；12 ℃ forever，擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)BmSPH33基因?qū)mNPV感染的響應(yīng) 利用primer5.0設(shè)計(jì)BmSPH33基因熒光定量特異引物(表 1)，以不同時(shí)間段ddH2O與BmNPV處理的家蠶中腸組織cDNA為模板，Bmactin3為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR，參照SYBR Primix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明進(jìn)行配制，反應(yīng)體系為20 μl(SYBR Premix ExTaqII 10 μl，ROX Reference Dye 50× 0.4 μl，F(xiàn)/R Primers 0.4 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 補(bǔ)齊20 μl)，擴(kuò)增程序：95 ℃30 s；(95 ℃ 30s，60 ℃ 30 s)× 40 cycles。ABI StepOnePlus儀器記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同處理的樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，收集基因的Ct值數(shù)據(jù)，最后根據(jù)2-△△Ct計(jì)算BmSPH33基因的相對(duì)表達(dá)量[18]。

表1 試驗(yàn)引物Table 1 Research primers

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSPH33基因序列生物信息學(xué)分析

對(duì)SilkwormDB公布的BmSPH33基因ORF進(jìn)行序列分析，BmSPH33ORF全長(zhǎng)為840 bp，編碼279個(gè)氨基酸殘基，軟件預(yù)測(cè)無信號(hào)肽序列，為非分泌型蛋白，去除信號(hào)肽后理論分子量大小為22.95 kDa，等電點(diǎn)為5.98。NCBI CDD在線預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，40～277位氨基酸為類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Trysin-like serine protease domain，Tryp_SPc domain)。利用PSIPRED Server在線軟件預(yù)測(cè)BmSPH33蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)，預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmSPH33蛋白由5個(gè)α螺旋、14個(gè)β折疊和一些無規(guī)則卷曲構(gòu)成；利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)特征一致而且以β折疊構(gòu)成為主。

圖1 預(yù)測(cè)的BmSPH33蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structure for BmSPH33 protein by server

圖2 預(yù)測(cè)的BmSPH33蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of for BmSPH33 protein by server

BmSPH33的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)：AK378171.1)與NCBI上登錄的蓓帶夜蛾SPH33(GenBank登錄號(hào)：ACR15983.2)進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，各序列中均含有類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(圖3)?；诓煌锓NSPH33蛋白氨基酸序列，利用MEGA5.0軟件，采用鄰接法對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(圖4)，遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，BmSPH33與蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)和冬尺蠖蛾(Operophterabrumata)SPH33在親緣關(guān)系上較近，其中不同節(jié)肢動(dòng)物的物種SPH33未聚在同一分支，而植物大葉杜鵑(Danausplexippusplexippus)SPH33與家蠶(Bombyxmori)、蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)和冬尺蠖蛾(Operophterabrumata)遺傳距離相近。

BmSPH33：家蠶SPH33；MacoSPH33：蓓帶夜蛾SPH33BmSPH33：Bombyx mori SPH33；MacoSPH33：Mamestra configurata SPH33圖3 BmSPH33與MacoSPH33氨基酸序列比對(duì)分析Fig.3 Sequence alignment of amino acid between BmSPH33 and MacoSPH33

圖4 BmSPH33與其同源氨基酸序列進(jìn)化分析Fig.4 Evolution analysis of amino acid between BmSPH33 with other homologues sequence

1:頭；2:血液；3:體壁；4:中腸；5:脂肪體；6:絲腺；7:精巢；8:卵巢1. Head；2: Hemocyte；3: Integument；4: Midgut；5: Fat body；6: Silkgland；7: Testis；8: Ovary圖5 家蠶不同組織BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄分析Fig.5 Transcription analysis of BmSPH33 gene in different tissues of Bombyx mori

2.2 BmSPH33基因組織表達(dá)譜分析

利用RT-PCR對(duì)5齡第3天家蠶各組織BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmSPH33在家蠶中腸組織中特異性表達(dá)(圖5)。

2.3 BmNPV感染家蠶后BmSPH33的轉(zhuǎn)錄分析

為探討B(tài)mSPH33基因在家蠶感染BmNPV病毒反應(yīng)中可能的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR對(duì)對(duì)照組(添食ddH2O)和實(shí)驗(yàn)組(添食BmNPV)BmSPH33基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，確定BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄水平是否發(fā)生變化。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶在感染BmNPV后BmSPH33基因發(fā)生響應(yīng)(圖6)，在感染BmNPV 4 h后BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄水平升高，而感染8、12、24、48 h時(shí)呈現(xiàn)下調(diào)，這說明家蠶在感染BmNPV后產(chǎn)生了應(yīng)激響應(yīng)，其中BmSPH33基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化。BmSPH33基因mRNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受到BmNPV病毒的誘導(dǎo)，提示BmSPH33基因在大造(P50)家蠶品種的抗病毒作用中發(fā)揮功能。

圖6 BmNPV對(duì)BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Effects of BmNPV inoculation on transcriptional level of BmSPH33 gene

3 討 論

絲氨酸蛋白酶SPs參與了昆蟲的消化、發(fā)育和免疫應(yīng)答，是一類重要的蛋白水解酶。研究BmSPH33與MacoSPH33氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們含有保守的Trypsin-like serine protease的結(jié)構(gòu)域，類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種Clip結(jié)構(gòu)域絲氨酸蛋白酶，被認(rèn)為能參與昆蟲先天免疫的蛋白酶[19-20]，其結(jié)構(gòu)含有保守的TAAHC、DIAL和GDSGGP特征基序。昆蟲經(jīng)過絲氨酸蛋白酶等一些酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)能將非活化前體酚氧化酶酶原(prophenoloxidase，proPO)催化形成活性的酚氧化酶原(Phenoloxidase，PO)，PO能把酚類氧化成醌類物質(zhì)，通過生成黑色素沉積在病原物表面，進(jìn)而黑化和包裹作用消滅病原微生物[21]。SPs蛋白通過剪切羧基端的一些特殊氨基酸而活化proPO[5]。

DNA microarray研究發(fā)現(xiàn)64個(gè)表達(dá)的SPs和SPHs基因中有38個(gè)基因中腸轉(zhuǎn)錄，其中大部分在中腸表達(dá)，一些中腸SPHs基因可能由于缺少活性位點(diǎn)殘基而處于非活動(dòng)狀態(tài)，但在其它鱗翅目昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了表達(dá)[22]，而且SPH1和SPH2還參與煙草天蛾的proPO活化過程[23]；家蠶BmSPH1證實(shí)了還參與家蠶的免疫響應(yīng)[16, 24]。家蠶中腸是消化桑葉并吸收營(yíng)養(yǎng)的重要場(chǎng)所，BmNPV病毒粒子隨著食物進(jìn)入中腸，它作為防御病毒入侵的第一道屏障，BmSPH33基因在家蠶中腸組織中特異表達(dá)(圖5)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmSPH33基因轉(zhuǎn)錄水平在感染4 h時(shí)上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)(8、12、24和48 h)下調(diào)，基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，表明BmSPH33基因表達(dá)受BmNPV誘導(dǎo)而參與家蠶幼蟲免疫應(yīng)答過程。

絲氨酸蛋白酶在真核細(xì)胞和原核生物中是高度保守和普遍存在的，它們已經(jīng)進(jìn)化成一個(gè)豐富而功能多樣的酶群。絲氨酸蛋白酶是一類主要的消化蛋白酶，占鱗翅目昆蟲消化活性的95 %[25]，由于BmSPH33與其BmSPs成員具有Tryp_SPc domain，昆蟲絲氨酸蛋白酶家族作為絲氨酸為活性中心的典型蛋白質(zhì)水解酶，結(jié)合其中腸特異表達(dá)，說明該蛋白主要參與食物消化，家蠶感染BmNPV后基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，推測(cè)該基因在家蠶免疫方面起到了輔助作用，但具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

BmSPH33基因在家蠶中腸組織中特異表達(dá)，且在家蠶感染BmNPV后發(fā)生響應(yīng)，推測(cè)該基因參與家蠶免疫應(yīng)答過程，結(jié)合BmSPH33含有高度保守的胰蛋白酶樣的底物基序，為弄清絲氨酸蛋白酶同源體BmSPHs在消化及免疫應(yīng)答方面的機(jī)制提供參考。