羅夢(mèng)瑤，王有國(guó)*，馬璐琳

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院, 云南 昆明 650201; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/ 云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心, 云南 昆明 650205)

【研究意義】鳶尾屬(IrisL.)植物花姿奇特，花色豐富艷麗，栽培歷史久遠(yuǎn)，為世界著名觀賞植物[1-2]。全世界鳶尾屬植物約有 300 余種, 生長(zhǎng)氣候以北溫帶為主，分布區(qū)域集中在亞洲、歐洲及北美洲。中國(guó)是鳶尾屬植物的分布中心之一，已知的鳶尾屬植物有64個(gè)種，13個(gè)變種，1個(gè)亞種和6個(gè)變型，主要分布于西南、西北和東北[3]。鳶尾(I.tectorumMaxim.)和西南鳶尾(I.bulleyanaDykes)都為鳶尾屬多年生草本植物，云南是鳶尾和西南鳶尾的主要分布地區(qū)之一。鳶尾在中國(guó)分布范圍相對(duì)較廣，主產(chǎn)地為四川、重慶、貴州、云南和廣西等地。鳶尾花冠大，花色藍(lán)紫色，花期較長(zhǎng)，在生態(tài)園林上有著廣泛的應(yīng)用前景，此外，其根莖“川射干”常用來藥用[2, 4]；西南鳶尾主要分布于中國(guó)西藏、四川、云南等地在海拔2300 ～ 3500 m的灌木林緣及水邊濕地上，花色藍(lán)色至藍(lán)紫色，外花被具藍(lán)紫色的斑點(diǎn)及條紋[5]。西南鳶尾花形美觀，具有很高的觀賞價(jià)值?？沙善N植于園林綠地中，也可以與其它植物搭配，豐富群落層次，增強(qiáng)景觀效果?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于鳶尾屬植物的研究主要集中在系統(tǒng)分類、栽培應(yīng)用、種子萌發(fā)、化學(xué)成分鑒定及細(xì)胞學(xué)研究等領(lǐng)域[4, 6-10]，而關(guān)于鳶尾屬植物分子生物學(xué)方面的研究較少，僅見少量鳶尾屬植物遺傳多樣性分子標(biāo)記[11-12]，以及鳶尾花色合成等相關(guān)基因的篩選克隆[13-16]等方面的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】純度好、濃度高的植物總RNA是進(jìn)行植物目標(biāo)基因克隆、表達(dá)及調(diào)控等研究工作的前提和基礎(chǔ)[17]。不同的植物因其組織成分、內(nèi)含化學(xué)物質(zhì)等的不同，適用的RNA提取方法也有很大的差別[18]，植物的花器官組織常因含有較多的多糖、酚類、色素等物質(zhì)，而影響花朵總RNA的提取質(zhì)量和得率[19-20]。多糖類物質(zhì)與RNA很難分離[21]，酚類物質(zhì)容易被氧化后同RNA結(jié)合[22]，傳統(tǒng)的使用三氯甲烷的抽提方式很難除去色素[23]，且植物材料的保鮮程度也會(huì)影響RNA的提取。另外，RNA結(jié)構(gòu)十分不穩(wěn)定，容易降解。因此，成功提取出品質(zhì)優(yōu)良的RNA至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 采用Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法3種方法提取鳶尾植物花朵RNA，并對(duì)RNA的質(zhì)量、產(chǎn)量以及試劑費(fèi)用等進(jìn)行對(duì)比分析，以期找出提取新鮮及冷凍的鳶尾植物花器官組織總RNA的最適方法，為后續(xù)鳶尾屬植物分子研究工作奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冷凍的西南鳶尾花蕾組織于2018年6月29日采自云南省迪慶州香格里拉縣城郊外，于液氮中處理后-80 ℃冰箱保存。新鮮的鳶尾花蕾于2019年3月6日采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綠化景觀帶。上述供試植物材料均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所供給。

1.2 試驗(yàn)試劑

Trizol Reagent購(gòu)于Invitrogen(美國(guó))公司；EasyPure Plant RNA Kit試劑盒和TransZol Plant試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；水飽和酚、三氯甲烷、異戊醇，異丙醇，無水乙醇，瓊脂糖，4×TBE緩沖液、RNase-free水、DEPC(Diethypyrocarbonate, 焦碳酸二乙酯)等均購(gòu)于昆明云科生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

臺(tái)式冷凍離心機(jī)、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；渦旋振蕩器購(gòu)于上海利聞科學(xué)儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌器購(gòu)于上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電子天秤購(gòu)于德國(guó)Sartorius公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；超純水機(jī)購(gòu)于南京賽飛生物科技有限公司；制冰機(jī)購(gòu)于深圳市伊雪商用制冷設(shè)備有限公司。

1.4 RNA提取

Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法均分別參照各試劑(盒)附帶說明書進(jìn)行操作。RNA提取所用的研缽、鑷子、量筒、三角瓶等凡是接觸RNA的非一次性器材和工具皆用0.1的DEPC水37 ℃過夜處理后高壓滅菌并烘干使用，離心管、槍頭等一次性耗材全部選用專用于RNA試驗(yàn)的耗材。RNA的溶解、稀釋及75 %乙醇的配制均使用RNase-free水。

1.5 RNA純度及濃度檢測(cè)

通過超微量分光光度計(jì)對(duì)采用Trizol法、EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法和TransZol Plant試劑盒法3種方法分別提取得到的鳶尾植物花蕾組織總RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)(檢測(cè)前先以RNase-free水作空白對(duì)照進(jìn)行調(diào)零)，并記錄各RNA樣品的濃度，以及所對(duì)應(yīng)的OD260/OD280的比值和OD260/OD230的比值。

1.6 RNA完整性檢測(cè)

各取2 μl提取得到的RNA樣品，加入1.5 μl的2×RNA Loading Buffer混勻后，在80 ～ 100 V電壓條件下，經(jīng)1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳30 min。電泳結(jié)束，通過凝膠成像系統(tǒng)檢查RNA的完整性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA純度及濃度比較

品質(zhì)優(yōu)良的RNA，其OD260/OD280的比值應(yīng)為1.8 ～ 2.1，OD260/OD230的比值應(yīng)當(dāng)大于2.0[24]。當(dāng)其OD260/OD280所得出的數(shù)據(jù)小于1.8時(shí)，意味著提取的RNA中含有較多的污染。這種污染可能來自于蛋白質(zhì)或其它的有機(jī)物。當(dāng)其OD260/OD280的數(shù)據(jù)大于2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)部分降解[25]。若其OD260/OD230數(shù)據(jù)小于2.0，則說明提取的RNA中也有污染[26]，這種污染可能來自蛋白質(zhì)、鹽類或次生代謝物。

由表1可知，對(duì)于冷凍的西南鳶尾花蕾組織，僅TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA基本符合要求，但RNA中依然含有鹽類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的RNA，OD260/OD280、OD260/OD230值都很低，蛋白質(zhì)和鹽分殘留多，不適于冷凍的西南鳶尾花蕾組織 RNA 的提??；對(duì)于新鮮的鳶尾花蕾，供試的3種方法提取出的總RNA的OD260/OD230值均小于2.0，表明存在一定雜質(zhì)，但其OD260/OD280的比值都在1. 7～2. 2，表明3種方法獲得的RNA結(jié)構(gòu)都較為完整，并未明顯降解。在RNA的純度上，3種提取方法高低排序依次為EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法>Trizol法>TransZol Plant試劑盒法，RNA的濃度上，依次為TransZol Plant試劑盒法>EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法>Trizol法。

表1 3種方法提取的冷凍西南鳶尾和新鮮鳶尾的花蕾組織總RNA質(zhì)量濃度和純度對(duì)比Table 1 Comparison of RNA concentration and purity of fresh I. tectorum Maxim.buds and frozen I. bulleyana Dykes buds extracted by three different methods

2.2 RNA 完整性比較

3種不同方法(試劑)提取出的新鮮鳶尾花蕾的RNA 各取2 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均能跑出條帶，且較為清晰，亮度較高(圖1)。Trizol法和TransZol Plant試劑盒法提取的RNA樣品，點(diǎn)樣孔顯示明亮殘余物質(zhì)(圖1)，說明仍有蛋白質(zhì)殘留。3種方法所提的RNA條帶均有彌散征象，有明顯的拖尾現(xiàn)象，說明RNA在提取過程當(dāng)中存在一定的降解。

冷凍的西南鳶尾花蕾RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA樣品在電泳時(shí)有條帶出現(xiàn)(圖2,TZ1～TZ8)，而Trizol法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的RNA樣品在電泳時(shí)無條帶出現(xiàn)(圖2,T1～T4,EP1～EP4)。TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA，點(diǎn)樣孔偶有亮點(diǎn)(圖2,TZ1、TZ4、TZ6、TZ7)，意味著該法也未能將蛋白質(zhì)等雜質(zhì)完全去除，但相較于其它2種方法，TransZol Plant 試劑盒法提取的RNA條帶清楚、亮度高，結(jié)果較好。

2.3 3種總RNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

由表2可見，對(duì)于新鮮的鳶尾花蕾，EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取的 RNA 純度和濃度均較高，能夠滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)的需求，且操作耗時(shí)較短，但提取試劑價(jià)格3者中最高。Trizol法提取的RNA的純度比較高，但獲得的RNA產(chǎn)量低，提取操作費(fèi)時(shí)，試劑價(jià)錢也較貴，不推薦選用。TransZol Plant試劑盒法提取的RNA，其純度較低，但產(chǎn)量很高，操作簡(jiǎn)便快捷，且價(jià)錢較低?？山Y(jié)合要求，在需要很高純度的RNA時(shí)選用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒，基本滿足后續(xù)試驗(yàn)即可但RNA的需求量較大時(shí)則選用TransZol Plant試劑盒。對(duì)冷凍的西南鳶尾花蕾組織，使用TransZol Plant試劑盒提取的RNA濃度高，品質(zhì)較好，就能滿足后續(xù)試驗(yàn)的需求，且操作耗時(shí)短，價(jià)格較低，可優(yōu)先推薦使用；而用 Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法提取 RNA的濃度和純度均不理想，不適合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，且操作時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用較高，不宜推薦使用。

表2 3種總RNA方法提取方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of RNA extracted by three methods

3 討 論

用Trizol搭配三氯甲烷、水飽和酚(酸性)、異戊醇、異丙醇等試劑使用，從液氮研磨過的植物材料中提取RNA的方法，在現(xiàn)階段最為常用[28]。但本研究結(jié)果顯示，無論對(duì)于冷凍的還是新鮮的鳶尾植物花蕾組織，Trizol 法提取得到的RNA的效果都不是很理想，究其原因，可能與鳶尾屬植物花蕾中含有的較多的多糖、酚類及色素等物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)在RNA的提取過程中會(huì)產(chǎn)生干擾，而Trizol 法無法完全阻止它們的干擾作用[27]。加之Trizol試劑價(jià)格較高，操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，因此不宜用于鳶尾植物花器官組織RNA的提取。

TransZol Plant試劑盒法能夠成功提取RNA，所依據(jù)原理是改良過的CTAB(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide, 十六烷基三甲基溴化銨)法[29]。試劑內(nèi)含有能夠結(jié)合酚類物質(zhì)的PVP(Polyvinylpyrrolidone, 聚乙烯基吡咯烷酮)和防止酚類物質(zhì)氧化的β-巰基乙醇，二者均可在一定程度上減弱酚類物質(zhì)對(duì)RNA提取的影響[24]。提取過程中搭配三氯甲烷、異戊醇等試劑，并聯(lián)合離心操作可以很好的去除蛋白質(zhì)和脂肪。因此，應(yīng)用TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA，其產(chǎn)量和純度一般都較高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：在3種方法中，盡管TransZol Plant試劑盒法提取出的RNA純度并不是最好的(對(duì)于新鮮的鳶尾花蕾材料而言)，且無法完全避免雜質(zhì)的污染，但即使是冷凍的植物材料對(duì)RNA的提取影響也不大，得到的RNA的產(chǎn)量和品質(zhì)也相對(duì)較穩(wěn)定。另外，應(yīng)用該試劑盒提取RNA耗時(shí)較短，且試劑盒價(jià)格較低，比較經(jīng)濟(jì)實(shí)用。對(duì)需要大量RNA但對(duì)RNA的質(zhì)量要求不是很高的試驗(yàn)可采用此法。

EasyPure Plant RNA Kit試劑盒采取柱式純化的方法完成RNA的提取，操作步驟比較簡(jiǎn)捷。根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法較適用于新鮮植物花器官組織總RNA的提取，而不適用于冷凍留存的植物材料。因其價(jià)格較高，在需要高質(zhì)量的RNA且可獲得新鮮的植物材料時(shí)可考慮使用。

4 結(jié) 論

根據(jù)植物材料類型(新鮮或冷凍)、對(duì)RNA 純度和產(chǎn)量的要求、試劑費(fèi)用及操作過程繁簡(jiǎn)程度等綜合因素考慮，TransZol Plant 試劑盒法更適合在需要大量RNA但對(duì)RNA的質(zhì)量要求不是很高時(shí)使用，且對(duì)于新鮮、冷凍的鳶尾植物花朵都較適合；EasyPure Plant RNA Kit試劑盒法適合于需求高質(zhì)量的RNA且有新鮮的植物材料時(shí)使用；Trizol法則不太適用于鳶尾花蕾RNA的提取。本研究結(jié)果為鳶尾屬植物后續(xù)的分子生物學(xué)研究工作提供一定前期基礎(chǔ)，也為其它植物花朵總RNA的提取提供參考。