鞏興龍，段夢琪，張 健，李雨晴，張芳芳，趙 雪，強(qiáng)巴央宗，商 鵬*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉(xiāng)畜牧水產(chǎn)中心，黑龍江 大慶 163000)

【研究意義】動物產(chǎn)肉性能與肉品質(zhì)一直以來都是廣大育種工作者關(guān)注的熱點(diǎn)，從分子水平研究豬肌肉組織生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制將為育種工作提供新的突破口。肌酸激酶(CK)作為唯一的磷酸原激酶，是參與Cr+MgATP2-+ H+←→ PCr+MgADP-反應(yīng)的關(guān)鍵酶[1-3]，主要為肌肉收縮及運(yùn)動提供能量[4-6]。它有4 種同功酶形式，包括肌型 (MM-CK)、腦型 (BB-CK)、雜化型 (MB-CK) 和線粒體型 (Mi-CK/MtCK)[7]。其中CK肌型肌酸激酶(CKM)是一種組織特異性酶，存在于各種肌肉細(xì)胞中，參與細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮以及三磷酸腺苷的再生[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，CKM基因敲除小鼠的肌肉組織的ATP合成能力明顯增強(qiáng)[9]。CKM基因主要在骨骼肌和心肌中高表達(dá)[10-11]，集中在M線附近[12]，在腦、肺和一些癌細(xì)胞中低表達(dá)[13]，而骨骼肌的發(fā)育與動物的產(chǎn)肉能力以及生長發(fā)育具有重要關(guān)聯(lián)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CKM基因在藏豬胚胎期背最長肌高表達(dá)，提出該基因與藏豬的慢生長和形態(tài)呈負(fù)相關(guān)[14]，意味CKM基因的高表達(dá)在藏豬中能抑制骨骼肌的生長發(fā)育以及降低藏豬的產(chǎn)肉能力。【本研究的切入點(diǎn)】本試驗(yàn)主要探究CKM基因在藏豬和大約克豬的多態(tài)性以及在不同組織的表達(dá)水平。【擬解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步了解CKM基因在豬體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選擇西藏自治區(qū)林芝地區(qū)(海拔約2900 m)飼養(yǎng)的藏豬和大約克豬為研究對象。藏豬(TP)來源于西藏農(nóng)牧學(xué)院藏豬養(yǎng)殖基地，大約克豬(YY)來源于林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地。共采集120 份耳組織(藏豬60 頭，大約克豬60 頭)，用于基因組DNA提取。選擇6 月齡大小的藏豬和大約克豬(各8 頭)進(jìn)行屠宰，分別采集肝臟、背最長肌及背脂組織各2 份，立即放入RNA保存液，液氮速凍，-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.2 DNA、RNA以及cDNA的制備與提取

采用苯酚氯仿抽提法從耳組織中提取基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop2000分光光度計(jì)檢測DNA濃度和質(zhì)量，RNase-Free ddH2O溶解，-20 ℃保存。

利用RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0584S)提取試驗(yàn)豬背最長肌、背脂和肝臟組織的總RNA。用Nano Drop2000分光光度計(jì)檢測RNA濃度和質(zhì)量，-80 ℃保存。

cDNA制備根據(jù)一步法cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成體系見表1。

表1 cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系(20 μl)Table 1 System of cDNA first strand synthesis reaction

反應(yīng)程序：溫和吹打混勻，42 ℃延伸30 min，85 ℃保溫5 min終止反應(yīng)；cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI網(wǎng)站中下載CKM基因(登錄號：NC_010448.4 )起始密碼子上游約3 kb區(qū)域DNA序列。使用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CKM基因的特異性引物，由上海生物工程有限公司合成，TE溶解，4 ℃保存。引物序列見表2。

表2 CKM基因 5’側(cè)翼區(qū)引物序列Table 2 Primer sequence of CKM gene 5 'lateral region

1.4 定量PCR引物設(shè)計(jì)與合成

1.4.1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI網(wǎng)站中下載已知豬的CKM基因的mRNA序列，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR擴(kuò)增引物，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物由上海生物工程有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，TE進(jìn)行溶解，4 ℃保存，引物序列見表3。

表3 定量PCR引物序列 Table 3 Primer sequences for quantitative analysis

1.4.2 熒光定量結(jié)果計(jì)算方法 熒光定量PCR每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，每個體系20 μl，含有1.0 μl cDNA，10.0 μl mix(Transgen)、7.8 μl ddH2O、正向和反向引物各0.6 μl(10.0 nmol/μl)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算CKM基因的mRNA水平。

ΔCT(樣品)=CT(樣品目的基因)-CT(樣品內(nèi)參基因)

ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)=CT(標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因)-CT(標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因)

ΔΔCT=ΔCT(樣品)-ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)

目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCT

1.5 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

從GeneBank下載CKM基因具有顯著突變位點(diǎn)的引物序列，利用在線軟件CONSITE (http://jaspar.binf.ku.dk/)，選擇脊椎動物，閾值設(shè)置80，把下載的突變前后的引物序列分別復(fù)制到軟件上，SCAN來預(yù)測SNPs位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

對個體測序測得數(shù)據(jù)結(jié)果，使用Chormas Pro軟件對測序峰圖進(jìn)行分析，使用Excel軟件計(jì)算各突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析基因型分布和基因型頻率的差異。對熒光定量結(jié)果，使用Excel進(jìn)行初步整理，使用SigmaPlot 10.0制備圖表，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

DNA提取結(jié)果顯示所提取的樣品DNA條帶比較清晰，無拖尾現(xiàn)象和其它雜帶的出現(xiàn)，未有蛋白質(zhì)的污染，說明提取的DNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿下一步實(shí)驗(yàn)需求，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 豬基因組DNA凝膠電泳結(jié)果圖Fig.1 Pig genomic DNA gel electrophoresis results

2.2 RNA提取結(jié)果

所提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，組織總RNA的28 S、18 S兩條帶比較清晰，無拖尾現(xiàn)象和其它雜帶的出現(xiàn)，也未有蛋白質(zhì)和DNA雜質(zhì)的污染，說明各組提取的總RNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿足后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量的需要，檢測結(jié)果見圖2。

圖2 組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Tissue total RNA agarose gel electrophoresis

2.3 SNP篩選與基因分型

藏豬、大約克豬混池測序結(jié)果見圖3，在CKM基因起始密碼子上游3 kb區(qū)域發(fā)現(xiàn)2 個C/T突變，位于起始密碼子上游1185處和1324處，記為C-1185T和C-1324T。并對藏豬、大約克豬基因型頻率和基因頻率結(jié)果卡方檢驗(yàn)進(jìn)行基因分型，經(jīng)檢驗(yàn)CKM基因C-1185T和C-1324T位點(diǎn)均符合Hardy-Wein berg平衡(P>0.05)?；蛐皖l率和基因頻率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 CKM基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 4 CKM gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

圖3 CKM基因SNPs位點(diǎn)測序峰圖Fig.3 Sequencing chromatograms for the SNPs of CKM gene

2.4 CKM基因的mRNA表達(dá)

通過使用熒光定量PCR技術(shù)對CKM基因在藏豬和大約克豬各組織中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：在3個組織中，CKM基因在藏豬背最長肌的表達(dá)量最高，其次是背脂和肝臟。其中，在背最長肌中，CKM基因藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克豬表達(dá)量(P<0.01)；在背脂中，CKM基因大約克豬表達(dá)量顯著高于藏豬表達(dá)量(P<0.05)；在肝臟組織中，CKM基因藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克豬表達(dá)量(P<0.01)。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

對SNPS位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CKM

*代表顯著性差異(P<0.05)，**代表極顯著差異(P<0.01)* Significant difference(P<0.05), ** Extremely significant difference(P<0.01)圖4 CKM基因在TP、YY 2個品種豬背最長肌、背脂、和肝臟中mRNA的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of CKM gene in longissimus dorsi,backfat and liver of TP and YY pigs

基因C-1185T位點(diǎn)突變前存在11 個轉(zhuǎn)錄因子，突變后存在10 個轉(zhuǎn)錄因子，其中6 個轉(zhuǎn)錄因子突變前后相同，較突變前5 個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化，新增4個轉(zhuǎn)錄因子Erg、EHF、ELK4和SPIB；C-1324T位點(diǎn)突變前存在6 個轉(zhuǎn)錄因子，突變后存在10 個轉(zhuǎn)錄因子，較突變前3 個轉(zhuǎn)錄因子沒有發(fā)生變化，新增7 個轉(zhuǎn)錄因子TEAD1、En1、NFKB1、REL、FOXI1、Foxd3和Foxq1。

3 討 論

CKM是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的4 種肌酸激酶亞型之一 ，定位在6號染色體上，是肌肉發(fā)育和分化的標(biāo)志[15]，是骨骼肌能量代謝的關(guān)鍵酶之一，是細(xì)胞生長信號途徑中的重要成分。本研究在CKM基因起始密碼子上游3000 bp區(qū)域中發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)C-1185T和C-1324T，該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在極顯著差異(P<0.01)。通過對這兩個突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)新增的轉(zhuǎn)錄因子大多與細(xì)胞生長發(fā)育、分化和代謝以及肢體發(fā)育密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子Erg、EHF和En1，轉(zhuǎn)錄因子Erg對于胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞凋亡機(jī)制的調(diào)控均有重要作用[16]，轉(zhuǎn)錄因子EHF廣發(fā)存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等過程[17]，轉(zhuǎn)錄因子En1與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，并在組織肌肉中持續(xù)表達(dá)[18]。揭示了這兩個多態(tài)性位點(diǎn)可能與肌肉的生長發(fā)育相關(guān)。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌、背脂和肝臟進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)CKM基因在背最長肌中的表達(dá)最高，且CKM基因在背最長肌的表達(dá)水平顯著高于背脂和肝臟組織。由此分析CKM基因在背最長肌中發(fā)揮重要作用。CKM基因在藏豬背最長肌中的表達(dá)水平極顯著高于大約克豬(P<0.01)，推測CKM基因在藏豬背最長肌中的高表達(dá)可能會抑制藏豬的肌肉發(fā)育及體型生長。這與商鵬研究發(fā)現(xiàn)CKM基因在豬胚胎發(fā)育期間肌肉組織的相對表達(dá)量在藏豬里面最高，烏金豬次之，大約克豬的表達(dá)量最低[14]結(jié)果相吻合。在本研究中，CKM基因在藏豬肝臟組織的mRNA表達(dá)水平顯著高于大約克豬(P<0.01)，肝臟調(diào)控機(jī)體代謝功能，基于CKM基因在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用，充分說明藏豬較大約克豬抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)[19]。CKM基因在藏豬和大約克豬的背脂表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)，推測可能與瘦肉型和脂肪型豬種有關(guān)。藏豬屬于脂肪性豬種，CKM基因的低表達(dá)促進(jìn)藏豬脂肪沉積，大約克豬屬于瘦肉型豬種，CKM基因在大約克豬背脂的高表達(dá)會抑制其脂肪沉積。具體分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步討論。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過對CKM基因起始密碼子上游3 kb區(qū)域進(jìn)行SNPs挑選，發(fā)現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C-1185T和C-1324T，且該位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格定律(P>0.05)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CKM基因在藏豬和大約克豬存在顯著差異表達(dá)，尤其CKM基因在藏豬背最長肌中的mRNA表達(dá)量極顯著高于大約克豬(P<0.01)。CKM基因在不同品種3個組織的表達(dá)水平說明CKM基因與骨骼肌的生長發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。本研究通過對CKM基因多態(tài)性及表達(dá)模式的分析，為進(jìn)一步研究CKM基因?qū)τ谪i的生長發(fā)育以及產(chǎn)肉能力提供理論依據(jù)，為藏豬種質(zhì)資源保護(hù)提供參考。