郭東光，陳明艷，李文明,2，王 豐，郭贊瑩，孫國鵬，李 鵬，岳 鋒，朱艷平，王選年

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院/動(dòng)物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，約70%的基因組被認(rèn)為是可以轉(zhuǎn)錄，但大部分為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)[1]。研究顯示，在人類基因組中存在約5.8萬個(gè)lncRNA，并且很多尚未經(jīng)過功能驗(yàn)證，被認(rèn)為只是作為轉(zhuǎn)錄“噪音”存在[2]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)中仍表現(xiàn)出其特異性的調(diào)節(jié)功能[3]。為此，綜述了lncRNA分子作用機(jī)制方面的相關(guān)研究內(nèi)容，如與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用，以及RNA編輯和修飾及其在免疫調(diào)節(jié)方面的影響等內(nèi)容，為深入了解lncRNA的分子作用機(jī)制及其生物學(xué)調(diào)節(jié)功能提供參考。

1 lncRNA的定義和分類

lncRNA是缺乏開放閱讀框架，且長度大于200 nt不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本[4-5]。按照是否大于200 nt，將非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)分為短鏈非編碼RNA和lncRNA，這種區(qū)分可以很容易將lncRNA與tRNA和miRNA(microRNA) 等不同功能的小RNA區(qū)分開。根據(jù)lncRNA相對于編碼蛋白和信使RNA(mRNA)基因座的位置及基因增強(qiáng)子調(diào)控元件，又分為基因間長鏈非編碼RNA(Long intergenic non-coding RNA,lincRNA)、內(nèi)含子lncRNA、反義lncRNA和增強(qiáng)子RNA(eRNA)。與mRNA一樣，多數(shù)lncRNA都有帽子結(jié)構(gòu)、剪接體和多聚腺苷酸尾巴[6]。相比之下，eRNA通常是由主動(dòng)增強(qiáng)子元件雙向轉(zhuǎn)錄而來，雖然沒有剪接體和多聚腺苷酸尾巴，但也具有帽子結(jié)構(gòu)[7]。然而，一些從調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄的RNA是單向多聚腺苷酸化的。因此，進(jìn)一步將RNA分為1d-RNA(單向多聚腺苷化)或2d-RNA(雙向的非聚腺苷化，長度相對較短)[8]。環(huán)狀RNA(circRNA)作為線性轉(zhuǎn)錄本的主要亞型，其通過自身3′和5′末端相連接后反向剪接而成，且不具有帽狀結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸化尾巴。迄今為止，已經(jīng)在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種circRNA[9]。

2 lncRNA的調(diào)節(jié)作用機(jī)制

隨著對lncRNA生物學(xué)調(diào)節(jié)功能研究的不斷深入，lncRNA調(diào)節(jié)作用的重要性已逐漸闡明。如長鏈非編碼RNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因(lncRNA Xist)對X染色體的沉默作用[10-11]；lncRNA H19在基因印記中的調(diào)節(jié)作用[12]；lncRNA-RoR(Regulator of reprogramming)在胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)分化中的調(diào)節(jié)作用及l(fā)ncRNA HOTAIR對乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用等[13-14]。與其他類型RNA相比，lncRNA沒有主要的分子原型，主要以模塊化結(jié)構(gòu)域的形式通過核酸堿基配對與DNA或RNA相互作用，或通過RNA高級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)相互作用[15-16]。此外，lncRNA自身的轉(zhuǎn)錄也可通過改變?nèi)旧|(zhì)可接近性或誘捕靶基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[17]。

2.1 lncRNA與DNA相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)lncRNA的調(diào)節(jié)功能是通過識別特定染色質(zhì)特征或RNA-DNA異源雙鏈或RNA-DNA-DNA三鏈來調(diào)節(jié)鄰近(順式)或遠(yuǎn)距離(反式)靶基因座的轉(zhuǎn)錄[18]。lncRNA可以與啟動(dòng)子序列形成穩(wěn)定的雙鏈，也可與成纖維細(xì)胞核糖體DNA啟動(dòng)子形成三鏈體結(jié)構(gòu)[19-20]。此外，lncRNA本身的轉(zhuǎn)錄可引發(fā)局部染色質(zhì)的變化，但該變化并非由非編碼轉(zhuǎn)錄本所介導(dǎo)[21]。在一項(xiàng)分析12個(gè)lncRNA介導(dǎo)的局部基因調(diào)控機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，雖然有5個(gè)lncRNA以順式作用調(diào)控相鄰基因的表達(dá)，但并不需要lncRNA轉(zhuǎn)錄本自身，而是依賴與其轉(zhuǎn)錄的相關(guān)過程，包括lncRNA啟動(dòng)子增強(qiáng)子活性、lncRNA的轉(zhuǎn)錄或剪接等[22]。

2.2 lncRNA與RNA相互作用

lncRNA也可通過RNA-RNA相互作用發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，如lncRNA EBER2通過與愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein barr virus，EBV)基因組末端重復(fù)位點(diǎn)(Terminal repeats,TR)的新生轉(zhuǎn)錄本雜交，將轉(zhuǎn)錄因子PAX5募集到TR中以調(diào)控TR附近基因的表達(dá)和病毒的裂解及復(fù)制過程[23]。RNA結(jié)合也是circRNA主要調(diào)節(jié)機(jī)制:一是以堿基配對的形式降低伴侶RNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，主要以 circRNA對miRNA的調(diào)控為主;二是作為miRNA“海綿”，通過競爭轉(zhuǎn)錄機(jī)制選擇性降低RNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄效率。除此之外，circRNA還可從其功能基因靶點(diǎn)準(zhǔn)確“滴定”miRNA，如circRNA ciRS-7可以通過與miR-7結(jié)合的70個(gè)位點(diǎn)準(zhǔn)確“滴定”miR-7的拷貝數(shù)，在中腦發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[24-25]。其調(diào)節(jié)機(jī)制是，ciRS-7可以完全抑制miR-7介導(dǎo)靶蛋白不穩(wěn)定性，并通過抑制miR-7使其靶向調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)豐度顯著上調(diào)。此外，circRNA Sry作為miR-138的“海綿”，可以抑制睪丸中miR-138靶蛋白的翻譯[24]?？梢?缺乏5′和3′末端的circRNA具有比線性RNA更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.3 lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用

lncRNA可以調(diào)節(jié)各種生物大分子的活性，其主要機(jī)制是單個(gè)lncRNA包含多個(gè)與DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合的模塊化結(jié)構(gòu)域。其中，DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)相互作用的模塊化配對是lncRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的一個(gè)重要機(jī)制，以招募通過化學(xué)修飾組蛋白調(diào)節(jié)基因表達(dá)的染色質(zhì)修飾蛋白[26]。如Xist結(jié)合多梳抑制性復(fù)合物(Polycomb repressive complex)后通過修飾抑制性組蛋白的位置可使非活性X染色體沉默[27]。lncRNA HOTTIP可通過與MLL組蛋白H3 Lys4(H3K4)-甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心亞基適配體WDR5結(jié)合來維持基因轉(zhuǎn)錄[28]。在免疫調(diào)節(jié)方面，lncRNA也可以與核糖核蛋白結(jié)合直接調(diào)節(jié)染色質(zhì)的可接近性、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的表達(dá)來調(diào)控病原體反應(yīng)受體下游信號通路[29-30]。

另外，eRNA和circRNA也可通過與蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。如eRNA可在啟動(dòng)子近端元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子YY1以穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子在靶基因組位點(diǎn)的占有率，通過RNase處理的染色質(zhì)可以減少啟動(dòng)子位點(diǎn)對這種功能性蛋白的捕獲，而使用 CRISPR-Cas9技術(shù)將eRNA與YY1結(jié)合位點(diǎn)相連，則可以增加YY1的占用率[22]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)的相互作用是其提高基因轉(zhuǎn)錄效率的主要機(jī)制[31]。此外，測序分析結(jié)果表明，與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合的大約有100個(gè)circRNA，而且多數(shù)是外顯子-內(nèi)含子circRNA，還包含一定數(shù)量的尚未剪接的全長轉(zhuǎn)錄本，并且其主要通過與小核糖核蛋白U1相互作用而增加其親本剪接的mRNA轉(zhuǎn)錄[31]。

3 lncRNA表達(dá)的細(xì)胞特異性

前人研究結(jié)果顯示，lncRNA表達(dá)的細(xì)胞特異性與它們在組織中的特異性功能密切相關(guān)，如在皮膚成纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)的lncRNA HOTAIR，對調(diào)控皮膚細(xì)胞位置同一性所必需的HOX編碼基因的表達(dá)至關(guān)重要[32]。在角質(zhì)細(xì)胞分化過程中顯著上調(diào)的終末分化誘導(dǎo)lncRNA(Terminal differentiation-induced lncRNA，TINCR)可誘導(dǎo)與屏障形成相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)[33]。此外，在ESC中共鑒定出226個(gè)特異性表達(dá)的lncRNA，約90%的lncRNA對ESC中的基因表達(dá)都具有顯著影響，而且每缺失一個(gè)lncRNA，大約會(huì)影響到175個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄。更為重要的是，這些特異表達(dá)的lncRNA可與染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子相互作用以維持ESC多能性并抑制其向終末細(xì)胞系的分化進(jìn)程[34]。

此外，在免疫細(xì)胞中，通過分析40多個(gè)小鼠T細(xì)胞群體的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，共鑒定出1 500個(gè)lncRNA的表達(dá)，約有50%是以T細(xì)胞亞群特有的方式表達(dá)。相比之下，只有6%～8%的mRNA具備這種細(xì)胞特異性[35]。而通過在不同人淋巴細(xì)胞中的研究，也獲得了相似結(jié)果，約有70%lncRNA在淋巴細(xì)胞中呈現(xiàn)特異性表達(dá)[36]。這些結(jié)果表明，細(xì)胞中特異性lncRNA的表達(dá)對細(xì)胞特異性功能的發(fā)揮至關(guān)重要。

4 lncRNA的編輯和修飾

RNA編輯和修飾是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的重要組成部分，揭示了RNA在細(xì)胞變化和信號基礎(chǔ)上的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制[37]。實(shí)際上，絕大多數(shù)RNA分子在轉(zhuǎn)錄過程中或轉(zhuǎn)錄后的整個(gè)生命周期中都會(huì)經(jīng)歷某種形式的編輯或修飾過程，相比于修飾前，這些特定修飾或堿基改變會(huì)明顯影響其功能，主要包括蛋白質(zhì)的募集、堿基突變讀出氨基酸的改變以及對RNA高級結(jié)構(gòu)的調(diào)整等[38]。從免疫學(xué)角度來講，RNA分子同樣處于免疫監(jiān)視之下，RNA分子的化學(xué)修飾會(huì)影響其免疫原性和功能，并且通過對特異位置的精確修飾可將RNA標(biāo)記為非致病性分子，這樣可以有效屏蔽細(xì)胞感受器中的核酸抑制其對RNA的免疫反應(yīng)[39]。此外，RNA編輯和修飾的紊亂對細(xì)胞表型變化及其發(fā)育都有重要調(diào)節(jié)作用[40]。

4.1 lncRNA的編輯

哺乳動(dòng)物中最常見的RNA編輯類型是在內(nèi)含子或基因間區(qū)發(fā)現(xiàn)的Alu元件中腺苷脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤誟41]。由于腺苷和肌苷有不同的堿基配對偏好，因此RNA編輯可以通過在體內(nèi)解開之前的雙鏈區(qū)而改變RNA結(jié)構(gòu)，這樣可有效消除觸發(fā)自身免疫的識別模式。因?yàn)榘|(zhì)RNA傳感器(如MDA5)可將長雙鏈部分識別為病原體[42]。雖然，大多數(shù)RNA編輯發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼基因(65%的mRNA)中，但也有一部分發(fā)生在ncRNA(10%)中[43]。例如腺苷脫氨酶(Adenosine-deaminase,ADAR)家族的酶催化腺苷到肌苷的脫氨作用涉及2個(gè)活性成員，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的ADAR1及僅在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的ADAR2[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)，這些酶的表達(dá)失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括精神分裂癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥和癌癥[45-47]。此外，研究還證實(shí)，ADAR酶缺失的小鼠有明顯的不利表型存在，表明RNA編輯是正常細(xì)胞分化過程的必經(jīng)階段[48]。

除此之外，根據(jù)ADAR疾病表型的影響及其lncRNA表達(dá)的組織特異性發(fā)現(xiàn)，ADAR廣泛參與細(xì)胞生物學(xué)功能過程的調(diào)節(jié)[49]。尤其是lncRNA上脫氨基反應(yīng)可改變lncRNA與miRNA結(jié)合的能力，是RNA編輯調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制。其中，lncRNAPCA3就是典型的例子，ADAR可作用于PCA3及其反義基因PRUNE2所形成的復(fù)合物來調(diào)節(jié)PRUNE2基因的表達(dá)。因PCA3-PRUNE2復(fù)合物還對雄激素受體的激活非常敏感，并且可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，ADAR通過調(diào)節(jié)PCA3與PRUNE2形成復(fù)合物的能力影響前列腺癌的進(jìn)展[50]。此外，ADAR1的編輯也可以通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞系的發(fā)育過程來調(diào)節(jié)細(xì)胞對外來核酸的監(jiān)測和干擾素應(yīng)答反應(yīng)[51]。

由于ADAR靶向外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域，可將其剪接形成circRNA，因此ADAR還與circRNA的表達(dá)豐度有關(guān)。然而，一旦ADAR對內(nèi)含子中的雙鏈區(qū)域過度編輯，則可導(dǎo)致circRNA表達(dá)降低[52]。此外，Alu元件也同樣存在于內(nèi)含子中，并受到ADAR酶的靶向調(diào)節(jié)。因此，腺苷-肌苷編輯的頻率取決于有多少ADAR酶存在，而ADAR表達(dá)的變化也與RNA編輯和circRNA產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)。 目前，已經(jīng)鑒定出超過100多種修飾現(xiàn)象，且主要集中在rRNA和tRNA[53]。

4.2 lncRNA的修飾

哺乳動(dòng)物中l(wèi)ncRNA和mRNA最常見的修飾是N-6甲基腺苷(N6-methyl-adenosine,m6A)修飾，這種修飾與許多細(xì)胞功能相關(guān)，包括翻譯、剪接、定位、穩(wěn)定性、分化、再生和免疫等調(diào)節(jié)功能[54]。此外，m6A修飾的位置具有明顯的序列特異性，并且在5′非翻譯區(qū)、終止密碼子和3′非翻譯區(qū)附近富集。m6A是一種動(dòng)態(tài)的修飾過程，在脊椎動(dòng)物中METTL3和METTL14是添加這種修飾復(fù)合物的核心組分，而含有YTH 區(qū)域、核糖蛋白hnRNPC和翻譯起始因子eIF3的蛋白質(zhì)能夠識別這種修飾或其相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)變化[55-56]。與m6A修飾有關(guān)的一個(gè)重要因素是m6A誘導(dǎo)了RNA二級結(jié)構(gòu)的變化，每個(gè)m6A通過在RNA雙鏈上施加1.5 kcal/mol的自由能，使之更有利于RNA單鏈構(gòu)象的形成[57-58]。此外，在免疫功能上，RNA雙鏈到單鏈的轉(zhuǎn)換也打開了RNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，降低了觸發(fā)先天免疫的雙鏈RNA區(qū)域的表達(dá)豐度。

在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中，m6A修飾的重要細(xì)胞功能之一是發(fā)出RNA非致病性信號，類似于包括來自ADAR活性的肌苷。如體外產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本上m6A修飾的存在可阻止對Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR) TLR3、TLR7和TLR8的識別，而未修飾的轉(zhuǎn)錄本則可識別這3個(gè)受體[59]。當(dāng)體外合成的轉(zhuǎn)錄本刺激樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)來源的細(xì)胞因子時(shí)，會(huì)導(dǎo)致含m6A的RNA誘導(dǎo)的TNF和IL-12相對較少。然而，不同的是，在含有m6A的轉(zhuǎn)錄本上刺激原代DC可分泌TNF，但是在同一轉(zhuǎn)錄本上如果加入假尿苷(Ψ)則可消除這種反應(yīng)，這表明原代DC對m6A和Ψ有不同的識別途徑。此外，RNA的m6A修飾可降低來源于單核細(xì)胞DC誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)CD80、CD83、CD86和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(Major histocompatibility complex class Ⅱ)類分子的能力，并且其誘導(dǎo)DC分泌細(xì)胞因子的能力還與細(xì)胞亞類和修飾的性質(zhì)和水平密切相關(guān)[59-60]。

5 lncRNA在動(dòng)物方面的研究及應(yīng)用

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，lncRNA在動(dòng)物方面的研究也有很多相關(guān)報(bào)道。如在調(diào)節(jié)肌肉分化方面，lncRNA TCONS_00815878和lncRNA-MEG3可以調(diào)控豬骨骼肌的生長和發(fā)育，并認(rèn)為可能是改良豬生產(chǎn)性能的重要調(diào)控基因[61-62]。lncR-125b可通過競爭性結(jié)合miR-125b來調(diào)控IGF2的表達(dá)，在羊骨骼肌分化過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[63]。此外，lncRNA的高通量測序結(jié)果表明，lnc_011371、lnc_007561 和 lnc_001728在山羊骨骼肌的不同發(fā)育階段可能發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[64]。為研究lncRNA在肉牛分子育種中的作用，已證實(shí)lncRNA MDNCR和lncRNA-MEG3可分別通過競爭性結(jié)合miR-133a[65]和miR-135[66]促進(jìn)牛骨骼肌成肌細(xì)胞分化和抑制成肌細(xì)胞增殖。

另外，lncRNA在動(dòng)物脂肪沉積中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用，通過對秦川牛脂肪組織中l(wèi)ncRNA的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在牛不同年齡階段脂肪沉積過程中具有重要作用[67]。另一項(xiàng)在牛脂肪細(xì)胞中的研究結(jié)果表明，lncRNA ADNCR 通過靶向調(diào)節(jié)Sirt1可以抑制牛脂肪細(xì)胞分化[68]。對萊蕪豬(LW)和大白豬(LY)的肌內(nèi)脂肪lncRNA表達(dá)譜分析和生物信息學(xué)研究結(jié)果顯示，XLOC_046142、XLOC_004398 和 XLOC_015408等 3個(gè)lncRNA可能在豬肌內(nèi)脂肪生成和脂肪沉積過程中起著重要的調(diào)控作用[69]。研究證實(shí)，LNC_000414被認(rèn)為是與豬肌內(nèi)脂肪生成密切相關(guān)的lncRNA，可以抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖和分化[70]。此外，lncRNA在動(dòng)物毛囊發(fā)育[71]、動(dòng)物疾病調(diào)控[72]，以及在水產(chǎn)動(dòng)物的生殖、胚胎發(fā)育、性別分化、免疫和代謝等[73]方面都發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

6 小結(jié)與展望

近年來，隨著對lncRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制比miRNA更加多樣，且生物學(xué)功能非常強(qiáng)大，已成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。lncRNA通過順式作用、反式作用和染色質(zhì)修飾、染色質(zhì)重塑等過程，影響了基因表達(dá)的激活和抑制。更為重要的是，單個(gè)lncRNA可以通過模塊化結(jié)構(gòu)域發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，經(jīng)常通過與DNA或RNA的相互作用將蛋白質(zhì)活性與DNA或RNA靶點(diǎn)聯(lián)系起來。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多人類和動(dòng)物性疾病都與 lncRNA表達(dá)紊亂有關(guān)，隨著研究的廣泛開展與深入，lncRNA相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制將進(jìn)一步得到闡明，并為疾病的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。因此，隨著對lncRNA的深入研究，新的作用機(jī)制和新的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，可為進(jìn)一步治療人類和動(dòng)物相關(guān)疾病以及在畜牧業(yè)中改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能提供指導(dǎo)。