馮 琪，田 琳,趙藝璇，張家培，劉冬云

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

鼠尾草屬(SalviaL.)植物作為北方常用地被植物，具有花期長(zhǎng)、花色艷麗、觀賞價(jià)值高等特點(diǎn)，在全國有多個(gè)種及品種，西南地區(qū)尤為突出[1]。鼠尾草具有“神奇的花園拯救者”的美名，可用于觀賞、入藥、烹飪等[2]。鼠尾草屬植物原產(chǎn)于熱帶，大多具有較強(qiáng)的耐熱性，易于栽培，花期很長(zhǎng)，是園林應(yīng)用中不可多得的好材料[3]。不同植物的花粉具有不同的形態(tài)，花粉是植物攜帶遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，根據(jù)植物種類的不同，花粉的活力和數(shù)量具有較大的變化[4]?；蚩梢钥刂评缧螤?、大小、極性等外部形態(tài)特征[5]和花粉的萌發(fā)器官及花粉外壁形成的雕紋(紋飾)特征[6]。其主要受內(nèi)環(huán)境影響，具有種的特異性?；ǚ鄣男誀畋憩F(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定[7]，不易受外界環(huán)境的影響，具有遺傳保守性[8]。通過花粉可以鑒別植物種，進(jìn)而在一定程度上反映植物遺傳多樣性，作為研究種質(zhì)資源遺傳多樣性的參考內(nèi)容。因孢粉學(xué)標(biāo)記具有簡(jiǎn)單、易操作等優(yōu)點(diǎn)，在眾多開花植物親緣關(guān)系研究中得到廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外使用掃描電鏡研究了獼猴桃(Actinidia)[9]、玉蘭(Yulania)[10]、懸鉤子(Rubus)[11]等的花粉形態(tài)，并探討了其系統(tǒng)分類學(xué)意義。此外，孫淑范等[12]研究了毛地黃鼠尾草花部性狀的變異及其對(duì)傳粉昆蟲訪花偏好的影響。但是目前關(guān)于鼠尾草屬植物花粉形態(tài)及其種內(nèi)分類關(guān)系的研究報(bào)道較少。為了明確鼠尾草屬部分觀賞植物的花粉形態(tài)特征，找尋它們之間的相似性及差異性，探究其中的進(jìn)化程度及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，收集了表現(xiàn)性狀良好、花期長(zhǎng)的國內(nèi)外5種鼠尾草屬植物，通過掃描電鏡對(duì)這5份材料的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，以期為鼠尾草屬植物系統(tǒng)演化研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料采自生長(zhǎng)良好、有穩(wěn)定花期的5種鼠尾草屬植物成熟的雄花序樣株上。植物名稱詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 在所選植物的盛花期收取成熟花粉，干燥處理，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 預(yù)處理 先用戊二醛固定液固定樣品(4 ℃)8 h以上，然后用去離子水對(duì)待測(cè)花粉進(jìn)行3次浸泡，3次時(shí)長(zhǎng)分別為6、7、8 min，再經(jīng)過不同純度的乙醇對(duì)花粉進(jìn)行脫水處理，順序及時(shí)長(zhǎng)：50%乙醇14 min→70%乙醇14 min→85%乙醇14 min→95%乙醇15 min→100%乙醇15 min。

表1 5種供試鼠尾草屬植物Tab.1 The name of the five tested species of Salvia L.

1.2.3 處理 將氣室制冷到10 ℃，放入樣品后，充滿液體CO2，靜置30 min后，放出CO2，重復(fù)3次。再次充入CO2，加熱45 min關(guān)閉總氣閥，慢慢放出氣體，取出樣品。

1.2.4 鏡檢 將花粉均勻彈撒在雙面導(dǎo)電膠上，用1%碳酸熏蒸后噴金。置于 HITACHI SU8010掃描電鏡上觀察。

1.2.5 觀察 選取有代表性的群體，對(duì)其赤道面、極面及紋飾隨機(jī)選取視野，進(jìn)行不同倍數(shù)的拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)供試材料的赤道軸長(zhǎng)(E)、極軸長(zhǎng)(P)、萌發(fā)溝寬，取平均值計(jì)算P/E值[4]。根據(jù)LAPIDOT等[13]對(duì)花粉形狀類型的劃分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類。使用Excel 2010、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。參考顧欣[14]、韓柏明等[15]的方法，以極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝寬為原始數(shù)據(jù)提取主成分，再根據(jù)5個(gè)品種鼠尾草的主成分得分進(jìn)行聚類分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉外部形態(tài)特征

5種鼠尾草屬植物花粉均以單粒形式存在(圖1)。如表2所示，玫瑰鼠尾草花粉赤道面觀和極面觀形狀均為近橢圓形；花粉極軸長(zhǎng)83.99 μm(78.4～87.1 μm)，變異系數(shù)為4.67%，赤道軸長(zhǎng)72.97 μm(70.4～76.2 μm)，變異系數(shù)為3.29%；P/E值為1.15。墨西哥鼠尾草花粉赤道面觀和極面觀形狀均為近橢圓形；花粉極軸長(zhǎng)65.70 μm(64.8～66.2 μm)，變異系數(shù)為0.98%，赤道軸長(zhǎng)56.09 μm(54.6～58.1 μm)，變異系數(shù)為2.63%；P/E值為1.17。櫻桃鼠尾草花粉赤道面觀和極面觀形狀均為長(zhǎng)橢圓形；花粉極軸長(zhǎng)77.49 μm(72.7～82.1 μm)，變異系數(shù)為4.92%，赤道軸長(zhǎng)67.09 μm(64.2～71.9 μm)，變異系數(shù)為5.16%；P/E值為1.16。鳳梨鼠尾草花粉赤道面觀和極面觀形狀均為長(zhǎng)橢圓形；花粉極軸長(zhǎng)82.26 μm(80.1～83.7 μm)，變異系數(shù)為1.90%，赤道軸長(zhǎng) 69.03 μm(66.5～72.4 μm)，變異系數(shù)為3.58%；P/E值為1.19。一串紅展望薰衣草紫花粉赤道面觀形狀為近橢圓形或長(zhǎng)圓形，極面觀形狀為長(zhǎng)橢圓形；花粉極軸長(zhǎng)120.71 μm(117.6～125.4 μm)，變異系數(shù)為2.78%，赤道軸長(zhǎng)81.89 μm(78.6～84.0 μm)，變異系數(shù)為2.88%；P/E值為1.23。

綜上，花粉的極軸長(zhǎng)在65.70～120.71 μm，跨度較大，花粉粒最大的為一串紅展望薰衣草紫，最小的為墨西哥鼠尾草；極軸長(zhǎng)的變異系數(shù)在0.98%～4.92%?；ǚ鄣某嗟垒S長(zhǎng)在56.09～81.89 μm，跨度較?。怀嗟垒S長(zhǎng)的變異系數(shù)在2.63%～5.16%。5種花粉的P/E值在1.15～1.23，均屬于長(zhǎng)球形花粉。

A: 玫瑰鼠尾草； B：墨西哥鼠尾草； C：櫻桃鼠尾草; D：鳳梨鼠尾草； E：一串紅展望薰衣草紫

表2 5種鼠尾草屬植物花粉的主要形態(tài)特征Tab.2 Main characteristics of five pollens morphology of Salvia L.

2.2 萌發(fā)孔與外壁紋飾特征

由圖1和表3可知，玫瑰鼠尾草花粉具有6條萌發(fā)溝，溝不等寬，溝緣平滑，溝間有突起。萌發(fā)溝寬約7.08 μm(6.9～7.3 μm)，幾乎達(dá)極，變異系數(shù)為2.82%。外壁紋飾為大網(wǎng)套小網(wǎng)紋飾，外層略厚于內(nèi)層，網(wǎng)眼內(nèi)有10～20個(gè)網(wǎng)孔，形狀多為不規(guī)則多邊形。網(wǎng)脊較粗。

墨西哥鼠尾草具有6條萌發(fā)溝，溝不等寬，溝內(nèi)有突起，溝緣略有粗糙。萌發(fā)溝寬約5.98 μm(5.5～6.5 μm)，幾乎達(dá)極，變異系數(shù)為7.01%。外壁紋飾為大網(wǎng)套小網(wǎng)紋飾，外層略厚，網(wǎng)眼內(nèi)約有10～20個(gè)網(wǎng)孔，形狀多為橢圓形或不規(guī)則圓形。網(wǎng)脊較粗，略有雜亂。

櫻桃鼠尾草具有6條萌發(fā)溝，溝緣平滑，溝較其他幾種深，萌發(fā)溝寬約3.63 μm(3.4～4.0 μm)，幾乎達(dá)極，變異系數(shù)為7.83%。外壁紋飾為大網(wǎng)套小網(wǎng)紋飾，外層厚包裹內(nèi)層。網(wǎng)眼內(nèi)約有5～15個(gè)網(wǎng)孔，形狀多為橢圓形或不規(guī)則圓形。網(wǎng)脊較粗，網(wǎng)孔內(nèi)有突起，略有雜亂。

鳳梨鼠尾草具有6條萌發(fā)溝，溝緣粗糙，溝較淺，萌發(fā)溝寬約7.98 μm(7.3～8.5 μm)，變異系數(shù)為6.41%。外壁紋飾為大網(wǎng)套小網(wǎng)紋飾，外層厚包裹內(nèi)層。網(wǎng)眼較大，內(nèi)包裹較多網(wǎng)孔，形狀多為橢圓形或不規(guī)則圓形。網(wǎng)脊較粗，略有雜亂。

一串紅展望薰衣草紫具有6條萌發(fā)溝，溝緣粗糙，萌發(fā)溝寬約18.52 μm(16.3～20.4 μm)，溝較長(zhǎng)，幾乎達(dá)極，變異系數(shù)為9.18%。外壁紋飾為3套網(wǎng)紋飾，網(wǎng)眼內(nèi)有2層網(wǎng)孔，多個(gè)小網(wǎng)孔圍繞一個(gè)大網(wǎng)孔，小網(wǎng)孔約有5～15個(gè)，形狀多為橢圓形或不規(guī)則圓形。網(wǎng)脊較粗，外層網(wǎng)包裹內(nèi)層。

表3 5種鼠尾草屬植物花粉的主要形態(tài)特征的多重比較Tab.3 Multiple comparison of main characteristics of five pollens morphology of Salvia L.

2.3 聚類分析

從圖2可以看出，在遺傳距離2.0處，鼠尾草的5個(gè)品種被劃分為3類，其中玫瑰鼠尾草、鳳梨鼠尾草、櫻桃鼠尾草聚為一類，墨西哥鼠尾草與一串紅展望薰衣草紫各自為一類；當(dāng)遺傳距離為4.0時(shí)，墨西哥鼠尾草與玫瑰鼠尾草、鳳梨鼠尾草、櫻桃鼠尾草合為一類，一串紅展望薰衣草紫聚類情況不變。

圖2 5種鼠尾草屬植物花粉形態(tài)指標(biāo)聚類分析Fig.2 The cluster of five species of Salvia L. based on pollen morphology indexes

3 結(jié)論與討論

花粉形狀、花粉粒大小、萌發(fā)溝寬[4]及數(shù)量[17]、條脊類群和條脊寬[18]等是花粉的超微形態(tài)特征。這些穩(wěn)定可靠的指標(biāo)能夠?qū)χ参锏目?、屬、種提供分析鑒別的依據(jù)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鼠尾草屬種(品種)的花粉在形狀、萌發(fā)溝位置、萌發(fā)孔位置、外壁紋飾等方面的相似性說明各種(品種)在屬的水平上高度統(tǒng)一：花粉形狀均為長(zhǎng)球形，赤道面和極面觀均為長(zhǎng)橢圓形或近圓形[20]，這與王開發(fā)等[21]的研究結(jié)果相一致。但在花粉超微形態(tài)方面，萌發(fā)溝寬變異最明顯，變異系數(shù)在2.82%～9.18%；赤道軸長(zhǎng)較穩(wěn)定，變異系數(shù)在2.63%～5.16%，赤道軸長(zhǎng)短及萌發(fā)溝寬等方面的差異說明鼠尾草屬種(品種)具有遺傳差異性。通過觀察，P/E值最穩(wěn)定，可作為區(qū)分不同品種的一項(xiàng)較為可靠的參數(shù)。經(jīng)顯著性分析，不同種(品種)間極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝寬存在極顯著差異(P<0.01)。由此可見，不同種鼠尾草屬植物花粉形態(tài)存在一定差異，可以鑒別植物種(品種)，進(jìn)而一定程度上反映植物遺傳多樣性。

花粉能夠用來作為植物親緣關(guān)系鑒定及分類研究的依據(jù)，是因?yàn)樗c其他器官不同，跟環(huán)境的關(guān)系不密切，具有遺傳穩(wěn)定性[22]。有關(guān)孢粉學(xué)在植物進(jìn)化方面的研究具有多種觀點(diǎn)，WALKER[23]認(rèn)為，被子植物的花粉是由大到小進(jìn)化的，比較原始的被子植物的花粉體積較大；而周守標(biāo)等[24]得出的花粉粒表面紋飾進(jìn)化規(guī)律則與ERDTMAN[25]有關(guān)被子植物的研究相一致，根據(jù)植物遺傳進(jìn)化規(guī)律，花粉形態(tài)上，外壁紋飾由光滑結(jié)構(gòu)向穴狀、條紋狀發(fā)展演化[26]。同時(shí)，條紋大小、寬窄等花粉外壁紋飾特征也可以成為衡量被子植物進(jìn)化程度的依據(jù)。本研究中，5種花粉粒大小排序：一串紅展望薰衣草紫>玫瑰鼠尾草>鳳梨鼠尾草>櫻桃鼠尾草>墨西哥鼠尾草。

花粉萌發(fā)孔的發(fā)育情況可以反映出植物進(jìn)化程度，萌發(fā)孔越簡(jiǎn)單，植物進(jìn)化程度越低[27]，花粉萌發(fā)孔為復(fù)合萌發(fā)孔的植物進(jìn)化程度較高[28]。本研究中，5種花粉除了一串紅展望薰衣草紫為3套網(wǎng)紋飾之外，其余外壁紋飾均為大網(wǎng)套小網(wǎng)紋飾；5種花粉均有6條萌發(fā)溝，一串紅展望薰衣草紫萌發(fā)溝最寬,為18.52 μm，變異系數(shù)最大，為9.18%。綜上所述，在這5種花粉中，一串紅展望薰衣草紫較為進(jìn)化，根據(jù)聚類分析來看，一串紅展望薰衣草紫與其他4種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)化程度高，而墨西哥鼠尾草等為較為原始的種。

由此可見，鼠尾草屬不同種(品種)植物花粉的形狀、外壁紋飾類型、極軸的長(zhǎng)度和P/E值可反映出種間的差異，也能反映出近緣物種間一定的進(jìn)化和親緣關(guān)系，為其分類及進(jìn)化研究提供一定的孢粉學(xué)依據(jù)?；ǚ弁獗诩y飾受基因控制，具有一定的穩(wěn)定性，但不同品種花粉形態(tài)具有一定相似性[29]，單憑孢粉學(xué)作為判斷品種間親緣關(guān)系及分類依據(jù)，還不夠全面，存在一定局限性，在今后研究中需要結(jié)合形態(tài)學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記等多方面對(duì)其進(jìn)行綜合分析。