孫斌杰 王 軍 楊倩倩 徐 艷 劉文強

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科（江蘇徐州 221000）

極低出生體質(zhì)量兒，作為新生兒中的特殊群體，對生后營養(yǎng)有更高的需求，但由于胃腸道功能發(fā)育不成熟，腸內(nèi)營養(yǎng)往往不能滿足生長發(fā)育需求，此時腸外營養(yǎng)顯得尤為重要[1]。臍靜脈置管作為一種中心靜脈置管，已有研究證實其能改善早產(chǎn)兒的生后早期營養(yǎng)狀況，尤其對于出生體質(zhì)量更低的早產(chǎn)兒，其在營養(yǎng)方面的優(yōu)勢更為顯著[2]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于極低出生體質(zhì)量兒。研究表明，正常腸道菌群對促進腸道功能發(fā)育，維持和調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能，促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟等方面有著十分重要的作用[3]，但新生兒期的腸道菌群定植受多種因素的影響，如胎齡、喂養(yǎng)、出生方式、醫(yī)療操作等[4]。有研究提出臍靜脈置管可影響靜脈導(dǎo)管關(guān)閉，一過性增加門靜脈壓力，導(dǎo)致腸黏膜相對缺血[5-6]，而腸黏膜缺血可導(dǎo)致腸上皮細胞損傷，腸黏膜屏障功能受損，從而可能增加機會致病菌屬、致病菌屬定植的機會?，F(xiàn)對于臍靜脈置管是否影響腸道菌群早期構(gòu)成的相關(guān)研究甚少。本研究通過高通量測序技術(shù)，了解臍靜脈置管是否對極低出生體質(zhì)量兒早期腸道菌群產(chǎn)生影響，探討臍靜脈置管對于極低出生體質(zhì)量兒的潛在風(fēng)險。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2019 年6 月至2020 年6 月收入新生兒重癥監(jiān)護室的極低出生體質(zhì)量兒為研究對象。研究對象納入標準：①出生胎齡＞28周且＜34周，性別不限；②出生體質(zhì)量＜1 500 g 且≥1 000 g；③分娩方式為剖宮產(chǎn)；④本院產(chǎn)科出生且在生后24小時內(nèi)入組；⑤至少存活至生后1周；⑥生后1周內(nèi)喂養(yǎng)早產(chǎn)兒配方奶，喂養(yǎng)方式為間歇鼻飼喂養(yǎng)；⑦生后早期經(jīng)驗性使用頭孢噻肟抗感染治療3天，隨訪無異常后停用。排除標準：①早期有創(chuàng)呼吸機輔助通氣；②存在先天性消化道畸形、遺傳代謝性疾病等；③生后7 天內(nèi)在母乳喂養(yǎng)；④因病情需要生后1 周內(nèi)使用益生菌或益生元；⑤患兒母親存在嚴重感染病史或產(chǎn)前24 小時內(nèi)使用抗 生素。

本研究征得患兒家長知情同意簽字，并經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 收集極低出生體質(zhì)量兒生后第1、3、7天的糞便至少0.25g，在24小時內(nèi)用凍存管收存，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 糞便菌群檢測 ①DNA提?。翰捎肞owerSoil DNA提取試劑盒（Mobio，美國），提取0.25 g糞便樣本中微生物總DNA，實際步驟按照試劑盒說明書進行。②PCR擴增：使用AB 9902?96well PCR儀，KOD FX Neo DNA 聚合酶，對糞便樣本 DNA 進行 16 S rDNA 的PCR 擴增。以引物27 F（5’-AGR GTT TGA TYN TGG CTC AG-3’）和1492R（5’-TAS GGH TAC CTT GTT ASG ACTT-3’）對16S rDNA的全長進行擴增。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)，72 ℃延伸7 min停止。PCR擴增產(chǎn)物使用1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結(jié)束后凝膠成像，并用ImageJ軟件定量，檢測合格的PCR產(chǎn)物使用全式金磁珠回收純化，具體流程嚴格按照說明書操作。③高通量測序：檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物在 Illumina Miseq平臺上進行16S基因全長測序。④生物信息學(xué)分析：對測序所得的原始序列進行校正，去除嵌合體，得到高質(zhì)量序列，在相似性為97%的水平上進行聚類，得到操作分類范圍（OTU），利用得到的OTU序列在細菌16S的Silva數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得物種信息，并進行生物信息學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2或校正χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

研究期間入院113 例極低出生體質(zhì)量兒，排除病情危重有創(chuàng)呼吸機輔助通氣32 例，生后1 周內(nèi)死亡5例，未能按照時間點采取糞便樣本9例，生后1周內(nèi)存在母乳喂養(yǎng)5例，生后早期感染加重更換抗生素15例，患兒母親存在產(chǎn)前抗生素使用史5 例，順產(chǎn)1 例，最后41例納入本研究。入選的41例新生兒中，男26例、女15例，出生胎齡30.0（29.3～30.6）周，出生體質(zhì)量（1.25±0.10）kg。

根據(jù)患兒臍殘端情況及家屬知情同意，共24例納入臍靜脈置管組，其余17例為非臍靜脈置管組；同時非臍靜脈置管組未進行經(jīng)外周中心靜脈置管，排除其他中心靜脈置管干擾，腸外靜脈營養(yǎng)均為24小時持續(xù)泵入。

臍靜脈置管組第1、3、7 天成功從樣本提取DNA并完成測序分別為2、15、21份，非臍靜脈置管組分別為1、11、15份。因第1天糞便樣本DNA提取率較低，其結(jié)果不予統(tǒng)計分析。

臍靜脈置管組與非臍靜脈置管組之間胎齡、出生體質(zhì)量，1分鐘及5分鐘Apgar評分，性別比，開奶時間，生后早期無創(chuàng)呼吸機輔助通氣類型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組腸道菌群多樣性比較

臍靜脈置管組與非臍靜脈置管組之間第3 天的shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而在第7天，臍靜脈置管組的shannon指數(shù)明顯低于非臍靜脈置管組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組腸道菌群門水平比較

臍靜脈置管組與非臍靜脈置管組的糞便菌群均以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門為主。第3 天兩組間各菌門相對豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第7天臍靜脈置管組變形菌門相對豐度大于非臍靜脈置管組，厚壁菌門及放線菌門相對豐度小于非臍靜脈置管組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 兩組腸道菌群屬水平比較

兩組樣本均以克雷伯菌屬、莫拉菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬為主要菌群，第3 天兩組間各菌屬相對豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第7 天臍靜脈置管組克雷伯菌屬相對豐度大于非臍靜脈置管組，雙歧桿菌屬及腸球菌屬相對豐度均小于非臍靜脈置管組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表1 兩組極低出生體質(zhì)量兒一般情況比較

表2 兩組極低出生體質(zhì)量兒各時間段菌群多樣性比較

表3 兩組極低出生體質(zhì)量兒各時間段主要細菌門水平相對豐度比較

表4 兩組極低出生體質(zhì)量兒各時間段主要細菌屬水平相對豐度比較

3 討論

人體腸道是細菌定植的主要場所，其所含有的細菌數(shù)量超過1014，是人體細胞數(shù)量的10～100倍[7]，具有數(shù)量巨大，多樣化，復(fù)雜性和動態(tài)性的特點[8]。正常的腸道菌群定植與宿主存在共生關(guān)系，有助于腸道功能發(fā)育、能量儲存與吸收、維持和調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能、促進宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育、抵抗病原體入侵 等[3,9]。但新生兒期腸道菌群構(gòu)成簡單，容易受到多種因素的影響，如胎齡、分娩方式、生活環(huán)境等[10]，直至3 歲左右，才能建立起一個相對穩(wěn)定的腸道微生態(tài)體系[11]。早產(chǎn)兒，尤其是極低出生體質(zhì)量兒，由于其體質(zhì)量低下，胃腸道功能發(fā)育不成熟，生后立即入住新生兒重癥監(jiān)護病房。由于腸道喂養(yǎng)延遲，抗生素使用以及受到多種醫(yī)療操作的影響，極低出生體質(zhì)量兒腸道菌群的組成勢必存在不同。研究已表明極低出生體質(zhì)量兒易發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥，可能與其獨特的腸道菌群構(gòu)成有關(guān)[12-13]。

臍靜脈置管作為一種中心靜脈置管，相比于經(jīng)外周中心靜脈置管、外周靜脈置管，有其獨特的優(yōu)勢[2,14]，在臨床上被廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究提出臍靜脈置管可影響靜脈導(dǎo)管關(guān)閉，一過性增加門靜脈壓力，導(dǎo)致腸黏膜相對缺血，進而引起壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生[5-6]。而壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生又與腸道菌群息息相關(guān)，不排除臍靜脈置管通過引起腸黏膜缺血而導(dǎo)致腸上皮細胞損傷，腸黏膜屏障功能受損，從而增加機會致病菌屬、致病菌屬定植，致使腸道菌群構(gòu)成發(fā)生改變。本研究旨在通過高通量測序技術(shù)測定極低出生體質(zhì)量兒的腸道菌群構(gòu)成，來思考臍靜脈置管這一侵入性操作對于患兒的潛在風(fēng)險。

極低出生體質(zhì)量兒作為一個特殊群體，其喂養(yǎng)不耐受發(fā)生率高達70%[15]。由于極低出生體質(zhì)量兒胃腸道功能發(fā)育不成熟、生后處于新生兒重癥監(jiān)護病房相對無菌環(huán)境中、抗生素應(yīng)用、常規(guī)氧療（影響腸道的相對無氧環(huán)境）[16]，均導(dǎo)致腸道菌群構(gòu)成與正常足月兒不同。既往已有研究證實喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生與腸道菌群多樣性下降存在聯(lián)系[16]，同時克雷伯菌屬相對豐度在喂養(yǎng)不耐受患兒中明顯升高，考慮克雷伯菌可能作為診斷喂養(yǎng)不耐受的標志物[17]。其機制可能是克雷伯菌屬過度生長，影響腸-腦軸的功能，打破腸道菌群平衡，導(dǎo)致腸上皮細胞損傷，抑制消化吸收功能，從而導(dǎo)致機體發(fā)生喂養(yǎng)不耐受[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)生后第3天兩組腸道菌群多樣性及克雷伯菌屬相對豐度無顯著差異，而在第7 天臍靜脈置管組菌群多樣性明顯下降，且克雷伯菌屬相對豐度明顯高于非臍靜脈置管組，這表明臍靜脈置管可能影響患兒腸道菌群構(gòu)成，降低菌群多樣性從而增加喂養(yǎng)不耐受的發(fā)生 風(fēng)險。

雖然隨著醫(yī)療技術(shù)進步，危重患兒的救治能力逐漸提高，但新生兒敗血癥，尤其是新生兒晚發(fā)型敗血癥，其發(fā)病率與致死率仍處于較高水平；且其發(fā)病率與新生兒出生體質(zhì)量、胎齡存在負相關(guān)關(guān)系。在極低出生體質(zhì)量兒中晚發(fā)型敗血癥發(fā)病率可達20%以上，同時死亡率可至18%，若為真菌感染，其死亡率將更高[19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)晚發(fā)型敗血癥患兒的腸道菌群多樣性明顯降低，同時乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌明顯減少[20]，表明腸道菌群的變化與晚發(fā)型敗血癥的發(fā)生存在潛在聯(lián)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非臍靜脈置管組相比，臍靜脈置管組在第7 天變形菌門豐度顯著升高，厚壁菌門豐度顯著降低；同時潛在致病菌屬，如克雷伯菌屬豐度明顯升高，而雙歧桿菌、腸球菌屬豐度明顯下降，菌群構(gòu)成較非臍靜脈置管組發(fā)生明顯變化。有研究表明糞腸球菌可提高腸道黏膜屏障完整性，與其他菌群一起調(diào)整微生態(tài)平衡，對病原體起到一定抑制作用[21-22]。而雙歧桿菌作為一種益生菌，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床，在維持腸道菌群平衡，提高機體免疫力和抗感染力以及控制內(nèi)毒素等方面起著十分重要的作用[16]，是人體健康的主要守護菌群。結(jié)合本研究結(jié)果，考慮臍靜脈置管可能降低菌群多樣性，減少雙歧桿菌及腸球菌的相對豐度，使?jié)撛谥虏【S度升高，進而降低腸道對于病原體的抵抗力，增加敗血癥發(fā) 生率。

綜上，本研究證實臍靜脈置管可改變極低出生體質(zhì)量兒的腸道菌群構(gòu)成，降低菌群多樣性，增加潛在致病菌屬相對豐度而減少有益菌的豐度。然而，臍靜脈置管是否增加喂養(yǎng)不耐受以及晚發(fā)型敗血癥等感染性疾病的風(fēng)險，但仍需進一步研究證實。同時本研究也為對臍靜脈置管的極低出生體質(zhì)量兒出生早期補充益生菌提供了理論基礎(chǔ)。既往研究表明益生菌的使用有助于預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎、腹瀉、喂養(yǎng)不耐受等疾病的發(fā)生，其作用機制為改善腸道黏膜屏障，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡并防止腸道感染病原體或細菌移位[23]。但具體如何進行干預(yù)仍有待進一步探索。本研究存在一定不足之處，首先樣本量較小，其次隨訪時間較短，未能遠期監(jiān)測患兒菌群變化及相關(guān)疾病的發(fā)生情況，仍需今后進一步開展大樣本的 研究。