閆鶴 梁慧賢

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)為革蘭氏陰性菌，是引起人與動(dòng)物感染的條件性致病菌[1]?，F(xiàn)成為繼大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)后，臨床排名第2位導(dǎo)致感染性疾病發(fā)生的腸桿菌科細(xì)菌[2]。2015—2016年，在澳大利亞的維多利亞州(Victoria)和昆士蘭州(Queensland)發(fā)生肺炎克雷伯菌感染，引起新生仔豬發(fā)生敗血癥，死亡率分別為60%和100%[3]。在我國(guó)滄州不同豬場(chǎng)收集的45株致病性肺炎克雷伯菌中，耐10種藥物的菌株占28.9%，β-內(nèi)酰胺耐藥基因blaTEM、氨基糖苷耐藥基因ant(3”)-Ia和aph(3’)-IIa、磺胺類耐藥基因sul2和sul3 5種耐藥基因檢出率在 80.0% 以上，β-內(nèi)酰胺耐藥基因blaSHV、氟苯尼考耐藥基因floR、喹諾酮耐藥基因qnrA3種耐藥基因檢出率在 37.8%～46.7%[4]。

肺炎克雷伯菌可分為經(jīng)典型(cKP)和高毒力型(hvKP)。鐵元素是其生長(zhǎng)的必需元素，為了在宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)和增殖，肺炎克雷伯菌通過分泌鐵載體因子，進(jìn)而從宿主鐵螯合蛋白中獲得鐵元素[5]。更為重要的hvKP通過分泌多種鐵載體因子，獲得更多的鐵元素，進(jìn)而增強(qiáng)致病性。肺炎克雷伯菌編碼幾種鐵載體，包括腸抑菌素、耶爾森桿菌素、沙門菌素和氣桿菌素[6]，以上4種鐵載體對(duì)毒力的表達(dá)和貢獻(xiàn)不同[7]。研究表明，腸桿菌素是肺炎克雷伯菌主要使用的鐵吸收系統(tǒng)，幾乎存在于所有類型的肺炎克雷伯菌中[8]。腸桿菌素合成由位于基因組上entABCDEF基因簇所編碼，而fepABCDG基因簇編碼蛋白介導(dǎo)其轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，僅有6%的cKP合成氣桿菌素[10]，而氣桿菌素是hvKP增強(qiáng)侵入性感染的主要毒力因子[11]。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)是一種基于7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)的核苷酸序列比對(duì)分析方法，被廣泛用于肺炎克雷伯菌菌株的分型[12]。全基因組序列正迅速成為預(yù)測(cè)肺炎克雷伯菌的抗生素耐藥性和致病潛力的強(qiáng)大工具，尤其是對(duì)了解相關(guān)菌株特征的持續(xù)進(jìn)化和地理分布具有重要意義[13]。目前針對(duì)豬源多重耐藥模式的肺炎克雷伯菌毒力基因的研究較少，本研究以分離自腹瀉的豬肝臟的ST37型肺炎克雷伯菌KP200為研究對(duì)象，進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，并研究鐵載體因子的遺傳多樣性，旨在為動(dòng)物源肺炎克雷伯菌的進(jìn)化及毒力研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

多重耐藥肺炎克雷伯菌KP200分離自某養(yǎng)豬場(chǎng)腹瀉豬的肝臟，該菌株KP200表現(xiàn)出對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和磺酰胺類抗生素的多重耐藥性。

1.1.2 相關(guān)試劑與儀器

Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。Pacbio RS II 測(cè)序儀，Pacific Biosciences公司生產(chǎn)；Illumina MiSeq測(cè)序儀，Illumina MiSeq公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組測(cè)序與注釋

將菌株KP200劃線接種至LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，再挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。DNA 提取按照細(xì)菌基因組 DNA 快速提取試劑盒說明書進(jìn)行。將得到的總DNA通過 Pacbio RS II 和Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行全基因組測(cè)序。全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)使用SPAdes v3.9.0和Canu v1.4軟件進(jìn)行組裝，將完整的基因組序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得該菌株的登錄號(hào)為 CP055293，并通過原核基因組注釋(PGAP)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)與功能注釋。采用 Glimmer 3.02 軟件進(jìn)行開放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)，將所有預(yù)測(cè)蛋白序列與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫 NR、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫、eggNOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp(E<10-10，E表示隨機(jī)情況下，獲得與當(dāng)前比對(duì)分?jǐn)?shù)相等或更高分?jǐn)?shù)的可能比對(duì)條數(shù))比對(duì)，完成蛋白序列功能注釋。

1.2.2 MLST分析

根據(jù)PasteurMLST 數(shù)據(jù)庫，確定7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)的等位基因號(hào)，得出肺炎克雷伯菌KP200菌株的ST型別。

1.2.3 單拷貝基因組進(jìn)化

在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查找已經(jīng)注釋的ST37型肺炎克雷伯菌全基因組，加上KP200共獲得161株全基因序列。統(tǒng)一使用prokka v1.14.6[14](默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行注釋得到基因文件和蛋白文件。使用orthofinder v2.4.0[15](推薦參數(shù))獲得所有(161株)菌株的單拷貝同源蛋白序列文件，使用muscle v3.8.31[16](推薦參數(shù))進(jìn)行多蛋白序列比對(duì)，MEGA X[17]使用默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建單拷貝核心同源蛋白序列最大似然樹(Maximum-likelihood，ML)，Bootstrap值設(shè)置為1 000次。

1.2.4 鐵載體因子分析

使用毒力因子VFDB數(shù)據(jù)庫，對(duì)肺炎克雷伯菌KP200和160株ST37型(NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫)肺炎克雷伯菌進(jìn)行鐵載體因子序列分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，展示161株ST37型肺炎克雷伯菌中有差異的鐵載體因子。

1.2.5 氣桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA分析

僅有16株ST37型肺炎克雷伯菌攜帶氣桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA，以KP200為參考菌株，進(jìn)行基因同源性比較，并根據(jù)iutA基因的核苷酸序列，利用軟件MEGA X構(gòu)建ML進(jìn)化樹(1 000 Bootstrap)。將高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044攜帶的iutA基因和KP200攜帶的iutA基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，研究KP200攜帶的iutA基因的堿基突變情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 肺炎克雷伯菌KP200基因組的基本特征

肺炎克雷伯菌KP200的基因組全長(zhǎng)為5 257 665 bp，平均堿基GC含量為58.78%，共有5 106個(gè)編碼基因。通過與eggNOG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，5 106 個(gè)編碼基因中有4 812個(gè)基因編碼的蛋白獲得COG(直系同源蛋白簇)功能注釋，占比為94.24%。COG功能注釋分布于22個(gè)COG的條目中，大多數(shù)注釋的基因與代謝有關(guān)，共占比38.856%。

2.2 MLST分析結(jié)果

根據(jù)PasteurMLST數(shù)據(jù)庫比對(duì)7個(gè)管家基因(rpoB- 1、gapA- 2、mdh- 2、pgi- 1、phoE- 13、infB- 9 和tonB- 16)，確定肺炎克雷伯菌KP200的分型為ST37。

2.3 單拷貝基因組進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中收集不同來源的160株ST37型肺炎克雷伯菌，其中人源109株、雞源9株、未知來源33株、環(huán)境來源8株以及食品來源1株；主要來自美國(guó)(34株)和中國(guó)(32株)。

基于全基因組水平的單拷貝基因分析表明，161株ST37型肺炎克雷伯菌共檢測(cè)到2 563個(gè)單拷貝基因?；诿恐昃膯慰截惢驑?gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，161株ST37型肺炎克雷伯菌主要位于4個(gè)不同的分支(見圖1)。KP200與人源肺炎克雷伯菌WCHKP030295的中國(guó)四川菌株位于相鄰的進(jìn)化分支，分離時(shí)間分別為2017年和2016年，相似度為99.8%，親緣關(guān)系較近。

圖1 161株ST37型肺炎克雷伯菌的最大似然樹Fig.1 Maximum-likelihood phylogeny of 161 Klebsiella Pneumoniae isolates

2.4 鐵載體因子分析

經(jīng)毒力因子VFDB數(shù)據(jù)庫對(duì)161株肺炎克雷伯菌基因組進(jìn)行30個(gè)鐵載體因子的分析，結(jié)果顯示不同分支的ST37型肺炎克雷伯菌之間鐵載體因子的分布存在一定的差異(見圖2)，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KP200含有3種鐵載體因子相關(guān)基因。

161株肺炎克雷伯菌基因組上均攜帶腸桿菌素基因entABCEF和fepABC，僅entD、fepD和fepG在161株肺炎克雷伯菌中的分布存在差異，結(jié)果表明腸桿菌素存在于所有的ST37型肺炎克雷伯菌中。

沙門菌素是通過染色體或者質(zhì)粒編碼的iroA基因簇iroBCDE進(jìn)行腸桿菌素的c-葡萄糖基化修飾而產(chǎn)生[9，18]，基因IroN介導(dǎo)了鐵負(fù)載形式的轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。重要的是，這種修飾可防止沙門菌素被蛋白Lcn2結(jié)合[20]，從而增強(qiáng)肺炎克雷伯菌在含有充足蛋白Lcn2的宿主中定植[21]，含有沙門菌素的肺炎克雷伯菌更具有毒性。對(duì)比結(jié)果表明，KP200攜帶iroE和iroN基因。僅有KP200和另外15株肺炎克雷伯菌攜帶iroN基因，對(duì)16株肺炎克雷伯菌攜帶iroN沙門菌素基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明該基因在核苷酸水平上高度保守，相似度達(dá)100%。

同一類型的鐵載體因子的毒力基因用不同顏色高亮顯示，其余使用橘黃色顯示，僅顯示161株中有差異的鐵載體因子

耶爾森桿菌素是耶爾森桿菌高致病性因子的一部分，發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌中也存在[22]。盡管在肺炎克雷伯菌中尚有待充分表征，但是普遍認(rèn)為合成耶爾森桿菌素蛋白是由基因irp編碼，分泌鐵載體需要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由ybt和fyu基因編碼，攝取受體由ybtQ基因編碼[23]。前人的研究表明，僅18%的經(jīng)典型肺炎克雷伯菌(cKP)攜帶耶爾森桿菌素[24]，KP200不攜帶耶爾森桿菌素相關(guān)基因。

氣桿菌素是一種檸檬酸鹽-異羥肟酸酯鐵載體[5]，由iucABCD基因簇編碼和iutA基因轉(zhuǎn)運(yùn)[25]。

對(duì)比結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌KP200和另外15株肺炎克雷伯菌攜帶氣桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA。

2.5 KP200與15株肺炎克雷伯菌攜帶的轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA的比較分析

iutA基因常作為識(shí)別高毒力肺炎克雷伯菌的特征基因之一[26- 27]。探究肺炎克雷伯菌KP200與另外15株肺炎克雷伯菌攜帶的iutA基因的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果見表1，由表1可知，16株肺炎克雷伯菌攜帶的iutA基因大小不同，KP200攜帶的iutA基因?yàn)? 190 bp；進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，KP200攜帶的iutA基因序列與其他15株肺炎克雷伯菌攜帶的iutA基因序列核苷酸相似性為73.49%～100%。

表1 15株分離株與KP200攜帶的iutA基因的比較結(jié)果

根據(jù)16株肺炎克雷伯菌攜帶的iutA的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。該進(jìn)化樹含有2個(gè)簇，與KP200攜帶的iutA核苷酸序列相似度高的序列聚在一個(gè)分支，與KP200攜帶的iutA核苷酸序列相似度低的序列聚在另一個(gè)分支。圖3表明，KP200攜帶的iutA核苷酸序列與肺炎克雷伯菌F10_AN攜帶的iutA核苷酸序列聚在一起，這與單拷貝基因組進(jìn)化分析結(jié)果相似。對(duì)比KP200與肺炎克雷伯菌F10_AN攜帶的iutA核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，KP200丟失前端6個(gè)堿基(ATGGAT)，推測(cè)在遺傳進(jìn)化過程中導(dǎo)致了堿基的丟失，是否影響iutA基因表達(dá)還需進(jìn)一步研究。

圖3 基于16個(gè)肺炎克雷伯菌的iutA序列的最大似然樹Fig.3 Maximum likelihood tree of 16 Klebsiella Pneumoniae isolates based on iutA sequence

2.6 KP200與NTUH-K2044攜帶的iutA基因的比較分析

肺炎克雷伯菌鐵載體因子發(fā)生突變可能影響其抵御宿主清除的能力[28]。研究表明，不同的毒力因子在肺炎克雷伯菌中存在不同的基因突變。ST37型肺炎克雷伯菌攜帶的iutA基因堿基突變情況尚無研究。3型菌毛毒力基因mrkD在不同型別的肺炎克雷伯菌中存在6種類型的基因突變[29]。氣桿菌素基因iuc譜系和肺炎克雷伯菌的型別在采樣點(diǎn)之間呈差異性分布[30]。比較KP200與高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)攜帶的iutA基因突變情況，將NTUH-K2044作為參考菌株[9，31- 32]。分析發(fā)現(xiàn)，KP200菌株攜帶的iutA基因前端缺少21個(gè)堿基，即缺少7個(gè)氨基酸。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，KP200菌株攜帶的iutA基因的堿基突變導(dǎo)致其編碼氨基酸序列也發(fā)生了相應(yīng)的變化(見圖4)，與NTUH-K2044相比較，KP200僅有兩個(gè)氨基酸不同：亮氨酸(L)替換成苯丙氨酸(F)，纈氨酸(V)替換成亮氨酸(L)。

僅顯示氨基酸縮寫，紅色表示突變氨基酸

進(jìn)一步研究堿基突變和氨基酸替換發(fā)現(xiàn)，KP200由于堿基替換，C835T導(dǎo)致了亮氨酸變?yōu)楸奖彼?L279F)，G2032C導(dǎo)致纈氨酸變?yōu)榱涟彼?V678L)。研究表明，在三甲醫(yī)院爆發(fā)的耐碳青霉烯的ST258型別肺炎克雷伯菌，攜帶的iutA基因的堿基突變?yōu)榉峭x的單核苷酸突變，突變的結(jié)果導(dǎo)致翻譯終止[33]，與本研究的分析結(jié)果不同。

3 結(jié)論

單拷貝基因組進(jìn)化分析表明，分離自病豬肝臟的ST37型別肺炎克雷伯菌KP200與1株來自中國(guó)人源的菌株具有較近的親緣關(guān)系。通過鐵載體因子的比較分析發(fā)現(xiàn)，所有ST37型肺炎克雷伯菌菌株攜帶腸桿菌素，KP200與其他15株肺炎克雷伯菌攜帶氣桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA，這些iutA基因序列間核苷酸相似性為73.49%～100%。基于iutA基因的序列的進(jìn)化樹結(jié)果表明，與KP200攜帶的iutA核苷酸序列相似度高的序列進(jìn)化關(guān)系更近。與高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044攜帶的iutA核苷酸序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KP200攜帶的iutA核苷酸由于兩處堿基突變，導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸替換。豬源ST37型肺炎克雷伯菌KP200攜帶的鐵載體因子毒力實(shí)際效果還需進(jìn)一步探究，有望為養(yǎng)殖場(chǎng)感染肺炎克雷伯菌問題提供研究方向和理論依據(jù)。