薛玉娟 陸愛(ài)東 王 毓 賈月萍 左英熹 張樂(lè)萍

北京大學(xué)人民醫(yī)院兒科（北京 100044）

近年來(lái)，得益于危險(xiǎn)度分層治療體系的不斷完善，兒童B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）的長(zhǎng)期生存率可達(dá)90%[1]，但復(fù)發(fā)仍然是導(dǎo)致兒童B-ALL治療失敗的最主要原因?；純后w內(nèi)的微小殘留?。╩inimal residual disease,MRD）又是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的罪魁禍?zhǔn)?，因此MRD是現(xiàn)代危險(xiǎn)度分層中的重要組成部分[2-3]。采用敏感、便捷的方法定期監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中的MRD 水平，并加強(qiáng)對(duì)MRD陽(yáng)性患者的治療是提高整體B-ALL兒童生存的關(guān)鍵[4]。流式細(xì)胞術(shù)是檢測(cè)MRD的常用方法，其臨床意義已被多項(xiàng)研究證實(shí)[5]。本研究通過(guò)回顧性分析北京大學(xué)人民醫(yī)院兒科B-ALL 患兒的數(shù)據(jù)，探究在MRD 指導(dǎo)危險(xiǎn)度分層及治療下，采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multi-parametric flow cytometry，MFC）監(jiān)測(cè)治療不同時(shí)間點(diǎn)MRD 水平與兒童B-ALL 預(yù)后的相 關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析自2014年9月至2017年12月北京大學(xué)人民醫(yī)院兒科收治的417例初診為B-ALL患兒的臨床資料。研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：①0～18周歲；②初發(fā)患兒（就診前未接受過(guò)任何ALL相關(guān)治療），給予規(guī)律治療及監(jiān)測(cè)，排除治療過(guò)程中放棄治療或轉(zhuǎn)院者；③臨床表現(xiàn)符合ALL，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)確診為B-ALL，診斷標(biāo)準(zhǔn)及危險(xiǎn)度分層參照文獻(xiàn)[6]。危險(xiǎn)度分層根據(jù)MRD水平再次調(diào)整，誘導(dǎo)治療第33 天骨髓MRD＜1×10-4歸入標(biāo)危組；誘導(dǎo)治療第33天骨髓MRD≥1×10-4且＜1×10-2歸入中危組；誘導(dǎo)治療第33天骨髓MRD≥1×10-2或第90天MRD≥1×10-3歸入高危組。

入選研究對(duì)象均采用改良的德國(guó)柏林-法蘭克福-蒙斯特（BFM）方案?；煼桨竻⒖純和疉LL診療建議[6]制定。誘導(dǎo)方案為CODPL，具體藥物包括環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、長(zhǎng)春新堿（vincristine，VCR）、地塞米松或醋酸潑尼松（dexamethasone/prednisone，DEX/Pred）、去甲氧柔紅霉素（idarubicin，IDR）、左旋門冬酰胺酶（native escherichia coli L-asparaginase，L-asp）。鞏固強(qiáng)化方案包括大劑量甲氨喋呤、大劑量阿糖胞苷等藥物序貫、交替使用。CODPL再誘導(dǎo)治療每半年進(jìn)行1輪，總計(jì)2輪。維持治療方案包括口服巰嘌呤及肌注甲氨蝶呤。所有患兒均接受甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松三聯(lián)鞘注預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。╟entral nervous system leukemia，CNSL），對(duì)已確診的CNSL患兒，給予較密集的三聯(lián)鞘注治療。

入組患兒根據(jù)性別、年齡（＜1歲、1～10歲、≥10歲）、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC≥50×109/L、＜50×109/L）、化療不同時(shí)間點(diǎn)（化療第15、33、90、180 天）不同MRD 水平（＜0.01%、0.01%～0.1%、0.1%～1%、1%～10%、≥10%）、危險(xiǎn)度分層（標(biāo)危、中危、高危）等因素進(jìn)行分組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過(guò)醫(yī)院病案查詢系統(tǒng)、科室?？苹純旱怯洸炯半娫掚S訪等方法，收集研究對(duì)象的臨床、實(shí)驗(yàn)室特征及預(yù)后療效等資料。

1.2.2 MRD 檢測(cè) 采用MFC 進(jìn)行骨髓MRD 檢 測(cè)。監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為化療第15、33、90及180天；檢測(cè)的單克隆抗體包括CD 58、CD 10、CD 34、CD 123、CD38、CD19、CD45、CD20[7]；檢測(cè)敏感度為10-4。

1.2.3 療效評(píng)估 完全緩解（complete remission，CR）：①骨髓原始幼稚淋巴細(xì)胞＜5%，且血常規(guī)恢復(fù)，即中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)＞1×109/L、血小板計(jì) 數(shù)＞100×109/L；②外周血無(wú)原始幼稚淋巴細(xì)胞且無(wú)髓外白血病證據(jù)。復(fù)發(fā)：獲得CR 后再次出現(xiàn)骨髓原始幼稚淋巴細(xì)胞＞5%，或出現(xiàn)髓外白血病。總生存（overall survival，OS）期：自診斷至死亡或末次隨訪日期。無(wú)事件生存（event free survival，EFS）期：自診斷至首次事件（復(fù)發(fā)、第二腫瘤及死亡）發(fā)生日期。隨訪截止日期為2020年4月15日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。OS和EFS以估計(jì)值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)，生存分析采用 Kaplan-Meier生存曲線，多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型（納入COX 比例風(fēng)險(xiǎn)模型的因素均為二分類變量）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般特征

共納入417例患兒，男240例（57.6%）、女177例（42.4%），中位年齡5.0（3.0～10.0）歲，中位WBC 12.4（4.3～32.5）×109/L。3 年OS 及EFS 分別為（90.9±1.4）% 和（85.2±1.7）%。ETV 6-RUNX 1+ALL 71例（17.0%），MLL+ALL16例（3.8%），E2APBX1+ALL 32例（7.7%），BCR-ABL1+ALL 40例（9.6%）。

標(biāo)危組132 例，男66 例、女66 例，中位年齡4.0（2.3～5.8）歲；中危組194例，男119例、女75例，中位年齡6.0（3.0～12.0）歲；高危組91例，男55例、女36例，中位年齡9.0（5.0～13.0）歲。WBC≥50×109/L 組69例，男40例、女29例，中位年齡6.0（3.0～11.0）歲；WBC＜50×109/L組348例，男200例、女148例，中位年齡5.0（3.0～10.0）歲。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（第33、90、180天）MRD均陰性組279例，男145例、女134例，中位年齡5.0（3.0～10.0）歲，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)MRD至少1次陽(yáng)性組 135例，男95例、女40例，中位年齡6.0（3.0～11.0）歲。見(jiàn)表1。

2 例患兒于誘導(dǎo)化療期因重癥感染死亡，余415例患兒第一療程CR 率為98.8%（410/415）。截至末次隨訪日期，共60 例患兒復(fù)發(fā)，其中單純骨髓復(fù)發(fā)49 例，單純中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)5 例，骨髓聯(lián)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)4 例，單純睪丸復(fù)發(fā)1 例，單純?nèi)橄購(gòu)?fù)發(fā) 1例。隨訪期間共41例患兒死亡，其中32例死于復(fù)發(fā)，5例死于感染，2例死于腦出血，1例死于肺出血，1例死于重癥胰腺炎。所有患兒的中位生存時(shí)間為44.0（33.7～56.2）月，3年OS及EFS率分別為（90.9±1.4）% 和（85.2±1.7）%。

2.2 不同分組與預(yù)后的關(guān)系

WBC ≥50×109/L 組3 年OS 及EFS 率均低于WBC＜50×109/L 組，3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)MRD 均陰性組的 3 年OS 及EFS 率均高于3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)MRD 至少1 次陽(yáng)性組，高危組的3年OS及EFS率均低于標(biāo)危和中危組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

417 例患兒中，第15、33、90 和180 天4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別有336、415、414、414 例接受了骨髓MRD 檢測(cè)。治療第15天，MRD≥10%組的3年OS及EFS率均低于其他MRD 水平組；治療第33 天，MRD ≥1%組的3年OS及EFS率均低于其他MRD水平組；第90天或180天，MRD≥0.1%組的3年OS及EFS率均低于其他MRD水平組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1及圖1、2。

COX 回歸分析顯示，化療第33 天MRD ≥0.1%和第180天MRD≥0.01%均是影響OS和EFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 治療第15 天及第33 天不同MRD 水平對(duì)患兒預(yù)后影響

3 討論

在兒童ALL 中如何進(jìn)一步完善危險(xiǎn)度分層，早期識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)患兒已經(jīng)成為近年研究的重點(diǎn)。MRD 水平反映了白血病患兒體內(nèi)腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)、微環(huán)境、宿主因素及治療敏感性等綜合因素對(duì)治療反應(yīng)的共同影響[8]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，MRD 是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)，可以識(shí)別早期治療反應(yīng)不良的患兒，并進(jìn)一步指導(dǎo)治療策略的選擇[5,9]。在St.Jude兒童醫(yī)院開(kāi)展的第十五號(hào)全面治療兒童ALL 的研究（NCT 00137111）中，使用MRD 指導(dǎo)治療的策略顯著提高了兒童ALL 的長(zhǎng)期生存，取得了5 年EFS 率85.6%的療效[9]。本研究也采用基于臨床、生物遺傳學(xué)特征、治療反應(yīng)和MRD 水平的綜合危險(xiǎn)度分層指導(dǎo)治療，3年EFS率為（85.2±1.7）%，這與既往國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果相一致[9-13]，再次驗(yàn)證了MRD 指導(dǎo)危險(xiǎn)度分層及治療的良好療效。

既往研究顯示，在兒童ALL中，即使在誘導(dǎo)及鞏固化療期進(jìn)行了基于MRD水平的治療調(diào)整，MRD仍然是提示預(yù)后的重要因素[14]。但關(guān)于不同監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同MRD 預(yù)測(cè)值尚存在爭(zhēng)議。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)和鞏固治療期的骨髓MRD 監(jiān)測(cè)均有重要意義，前者用于早期治療反應(yīng)及危險(xiǎn)度分層的評(píng)估，并指導(dǎo)鞏固治療策略的選擇；后者用于維持治療強(qiáng)度的調(diào)整，并指導(dǎo)MRD水平復(fù)發(fā)時(shí)的挽救治療策略[15]。本研究選擇在第15、33 天誘導(dǎo)化療期和第90、180 天鞏固化療期監(jiān)測(cè)骨髓MRD，并分別界定自0.01%至10%等不同的MRD 比較水平，結(jié)果顯示，第15、33、90、180天的MRD 水平均有預(yù)后提示意義。但不同時(shí)間點(diǎn)的MRD 閾值有所不同，第15 及33 天的MRD 預(yù)測(cè)水平分別為10%和0.1%，而第90和180天的預(yù)測(cè)水平則均為0.01%。而COX回歸分析顯示，第33天（0.1%）和180 天（0.01%）的MRD 水平是獨(dú)立的預(yù)后影響因素，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[9,12,15-16]，且本研究中的MRD 預(yù)測(cè)定位時(shí)間點(diǎn)及精確度更高。此外，本研究還比較了在第33、90 及180 天3 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)全部達(dá)到MRD 陰性的患兒與至少1 次未達(dá)到陰性患兒的生存情況，發(fā)現(xiàn)兩組間的差異也有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了兒童B-ALL 治療過(guò)程中連續(xù)監(jiān)測(cè)MRD 的必 要性[17]。

MFC和RT-PCR是進(jìn)行白血病MRD檢測(cè)最常用的兩種方法[18]。相較于RT-PCR檢測(cè)，MFC覆蓋面更廣、性價(jià)比更高，且方便省時(shí)，所以在臨床工作中適用性更廣，但RT-PCR的檢測(cè)靈敏度更高。相關(guān)研究建議，條件允許的情況下可將兩者結(jié)合應(yīng)用以提高M(jìn)RD檢測(cè)的準(zhǔn)確性和普及性[18]。本研究采用MFC 檢測(cè)417例B-ALL患兒不同時(shí)間點(diǎn)的MRD，發(fā)現(xiàn)MRD與患兒預(yù)后的明確相關(guān)性，也再次驗(yàn)證了MFC檢測(cè)MRD的可靠性。

綜上所述，MRD 指導(dǎo)治療下，誘導(dǎo)治療第33 和180 天的骨髓MRD 水平是提示兒童B-ALL 預(yù)后的敏感指標(biāo)。在兒童B-ALL 的治療過(guò)程中應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)MRD。