張恕銘,曾林,孫向陽,汪杰,孫擎,張慶*,譚霄

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都,610039)2(四川國檢檢測有限責(zé)任公司,四川 瀘州,646000)3(中國科學(xué)院大學(xué) 中國科學(xué)院成都生物研究所,四川 成都,610041)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是廣泛存在于植物、動物和微生物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。在哺乳動物腦組織中,GABA是一種重要的抑制性遞質(zhì),具有降血壓、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、利尿、改善腦機(jī)能、增進(jìn)腦活力等功能活性[2-3]。此外,還具有抗熱應(yīng)激和提高飼料利用率等作用[4]。因此GABA被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、保健品及農(nóng)業(yè)等行業(yè)[5]。目前,合成GABA主要有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物合成法,其中微生物合成法具有條件溫和、安全性好、耗能低等優(yōu)點(diǎn)[6-8],因此近年來微生物合成法制備GABA受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA是由谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸,其中對紅曲霉、釀酒酵母、乳酸菌等[9]研究較為深入,特別是大家公認(rèn)的食品級細(xì)菌乳酸菌用于合成GABA受到人們的青睞。然而微生物合成法制備GABA產(chǎn)量較低,因此提升GABA產(chǎn)量成為了目前研究的熱點(diǎn)。

近年來,共培養(yǎng)作為一種新穎的培養(yǎng)技術(shù),由于具有能夠獲得某些純培養(yǎng)技術(shù)無法獲得的產(chǎn)物及有效提高產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點(diǎn),已在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9]。YAN等[10]將腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和戊糖乳桿菌(Lactohacilluspentosus)接種于泡菜中進(jìn)行共發(fā)酵,發(fā)酵后的泡菜中腐敗微生物的數(shù)量相對減少且亞硝酸鹽的濃度也降低,此外風(fēng)味有所改善；KWON等[11]通過腸膜明串珠菌與植物乳桿菌共發(fā)酵水芹菜,其中GABA含量得到明顯的提高；LEE等[12]將2株乳酸菌進(jìn)行共發(fā)酵來提高GABA的產(chǎn)量；ZHANG等[13]將利用釀酒酵母和植物乳桿菌共培養(yǎng)來提升發(fā)酵桑葚飲品中GABA的產(chǎn)量。屎腸球菌是存在于哺乳動物腸道中且對人體具有益生作用的乳酸菌,目前以屎腸球菌和植物乳桿菌共培養(yǎng)發(fā)酵來提高GABA產(chǎn)量的研究尚未見報(bào)道。

本研究以從四川泡菜中分離篩選獲得的產(chǎn)GABA屎腸球菌AB157和不產(chǎn)GABA植物乳桿菌BC112為發(fā)酵菌株,探討采用共培養(yǎng)發(fā)酵提升GABA產(chǎn)量,利用響應(yīng)面分析法對共培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,分析谷氨酸脫羧酶的酶活,旨在為采用共培養(yǎng)發(fā)酵提高GABA產(chǎn)量及后續(xù)對菌株共培養(yǎng)發(fā)酵機(jī)理探討提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)GABA的屎腸球菌AB157(EnterococcusfaeciumAB157,NCBI登錄號MH578625)、不產(chǎn)GABA的植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBC112,NCBI登錄號為KU761835),西華大學(xué)古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所保藏。

丹磺酰氯,成都華夏化學(xué)試劑有限公司；γ-氨基丁酸,上海金穗生物科技有限公司；L-谷氨酸鈉,成都市科龍化工試劑廠。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,乙酸鈉5 g,KH2PO42 g,檸檬酸銨2 g,吐溫-80 1 mL,硫酸鎂0.5 g,硫酸錳0.25 g,用蒸餾水定容至1 L,pH 6.2,121 ℃滅菌15 min備用。改良MRS液體培養(yǎng)基：以含有0.5%L-谷氨酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,根據(jù)不同需要進(jìn)行優(yōu)化,培養(yǎng)基成分進(jìn)行相應(yīng)的變動。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104電子分析天平,上海舜宇恒平有限公司；pHS-3C酸度計(jì),成都方舟科技公司；Allerga X-15R冷凍離心機(jī),美國Thermos scientific公司；JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞破碎機(jī),寧波新芝生物科技有限公司；SpectraMax i3X酶標(biāo)儀,美國分子儀器有限公司；GM-0.33AL隔膜真空泵,天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Waters2695高效液相色譜儀,美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GABA含量測定

參照譚霄等[14]利用鄰苯二甲醛衍生的方法測定發(fā)酵液GABA產(chǎn)量,HPLC色譜條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm,5 μm)；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為甲醇,流動相B為醋酸鈉(pH 6.2)-甲醇-四氫呋喃(84∶15∶1,體積比)；流速為1 mL/min；梯度洗脫時,流動相B比例為：0～6 min,80%～50%；6～9 min,50%～20%；9～10 min,20%～0%；10～11 min,維持0%；11～15 min,返回80%。

1.3.2 共培養(yǎng)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)查閱文獻(xiàn)及前期試驗(yàn)篩選[15],以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,按屎腸球菌AB157、植物乳桿菌BC112各4%的接種量,培養(yǎng)溫度為30 ℃,分別以不同體積比的比例接種(1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1)；不同底物質(zhì)量濃度(3、6、9、12、15、18 g/L)；不同發(fā)酵時間(12、24、36、48、60、72、84、96 h)為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取相應(yīng)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn),利用Design-Expert 8.0.6軟件,以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,確定共培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)GABA的最佳條件。因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of response suface methodology

1.3.3 GAD酶活力測定

1.3.3.1 GAD粗酶液制備

參照趙偉睿[16]的試驗(yàn)方法。取發(fā)酵液5 mL,6 000 r/min,4 ℃離心10 min,PBS溶液洗滌3次；加入Na2HPO4-檸檬酸鈉緩沖液懸浮菌體；冰浴細(xì)胞破碎。破碎條件：功率為220 W,時間10 min,超聲時間20 s,間隔時間20 s。

1.3.3.2 GAD酶活力測定

取谷氨酸脫羧酶酶液400 μL,與等體積L-MSG(10 g/L,用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)混合,加入1 mmol/L的磷酸吡哆醛,37 ℃反應(yīng)20 h。

GABA的HPLC分析：將反應(yīng)液13 000 r/min離心10 min,取上清液煮沸10 min,再離心20 min取上清液進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件同1.3.1小節(jié)。

酶活力單位定義：在37 ℃條件下,每毫升粗酶液1 h產(chǎn)生1 μmol GABA定義為一個酶活單位,單位U,即1個活力單位=1.0 μmol/(mL·h)。酶活力計(jì)算如公式(1)：

酶活力=(ρ×V×1 000)·(MGABA×0.4×20)-1

式中：ρ為GABA質(zhì)量濃度,mg/L；V為酶反應(yīng)總體積,mL；0.4為測定時所取酶液量,mL；20為反應(yīng)時間,h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD：最小顯著差數(shù)法),柱狀圖Origin 8.5進(jìn)行繪制。每組試驗(yàn)設(shè)置3個平行,所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物濃度對共培養(yǎng)產(chǎn)GABA的菌體數(shù)量的影響

底物質(zhì)量濃度對GABA產(chǎn)量和菌體生長影響結(jié)果如圖1所示,共培養(yǎng)能夠提高GABA的質(zhì)量濃度。L-谷氨酸鈉添加量為12 g/L時,共培養(yǎng)GABA含量達(dá)3.86 g/L,此時單菌發(fā)酵GABA產(chǎn)量為1.60 g/L,提高了2.41倍。由菌體量分析可知,單菌株發(fā)酵過程中隨著底物濃度的增加,細(xì)胞滲透壓增大影響微生物生長；而共培養(yǎng)體系中,隨著底物質(zhì)量濃度增加,菌體量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,共培養(yǎng)體系微生物能夠耐受更高底物濃度,微生物之間的關(guān)系復(fù)雜,包括互惠共生、競爭及信號分子等都可以對體系中微生物生長及目標(biāo)產(chǎn)物生成有影響[17-20],具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

a-底物質(zhì)量濃度對GABA產(chǎn)量的影響;b-底物質(zhì)量濃度對菌體數(shù)量的影響圖1 底物質(zhì)量濃度對GABA產(chǎn)量及菌體數(shù)量的影響Fig.1 Effect of sodium substrate concentration on the content of GABA and cell density

2.1.2 接種比例對共培養(yǎng)產(chǎn)GABA和菌體數(shù)量的影響

不同接種比例對GABA產(chǎn)量和菌體生長影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 屎腸球菌與植物乳桿菌接種比例對GABA產(chǎn)量和菌體數(shù)量的影響Fig.2 Effect of strain ratio (E.faecium∶L.plantarum) on the content of GABA and cell density

當(dāng)屎腸球菌AB157和植物乳桿菌BC112的接種比例為1∶1時,GABA產(chǎn)量最高,達(dá)4.02 g/L。一種細(xì)菌的代謝產(chǎn)物可能會影響其他細(xì)菌的生長代謝[21],在共培養(yǎng)體系中,植物乳桿菌BC112的代謝產(chǎn)物可提高屎腸球菌AB157產(chǎn)GABA的能力。

2.1.3 發(fā)酵時間對共培養(yǎng)產(chǎn)GABA和菌體數(shù)量的影響

發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量和菌體數(shù)量影響結(jié)果如圖3所示。共培養(yǎng)的GABA產(chǎn)量隨時間延長而增加,在發(fā)酵84 h時GABA產(chǎn)量達(dá)到最大為4.13 g/L,隨后趨于穩(wěn)定,而單菌發(fā)酵GABA產(chǎn)量為1.26 g/L。因此,選擇84 h為最優(yōu)發(fā)酵時間。

a-發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量的影響;b-發(fā)酵時間對菌體數(shù)量的影響圖3 發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量及菌體數(shù)量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on the content of GABA and cell density

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),以L-谷氨酸鈉(A)、接種比例(B)和發(fā)酵時間(C)作為自變量,GABA產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值。以L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度12 g/L、接種比例1∶1(體積比)和發(fā)酵時間84 h為響應(yīng)面分析中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，如表2所示。采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析建立二次響應(yīng)回歸模型,擬合得到回歸方程：

Y=6.35+0.29A+0.20+0.092C-0.011AB+0.066AC-0.39A2-0.16B2-0.49C2

回歸模型方差分析結(jié)果見表3,模型P值達(dá)到了極顯著水平,說明該模型顯著回歸。模型失擬項(xiàng)P<0.05,差異不顯著,說明回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好,試驗(yàn)誤差小,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2,表明采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)所得的回歸模型有效,適用于共培養(yǎng)發(fā)酵GABA優(yōu)化條件試驗(yàn)的理論預(yù)測。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與響應(yīng)值Table 2 Treatment incorporations and responses of response surface methodology

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Analysis of statistical significance of each regression coefficient in the RSM model and variance for the experimental results of RSM design

在交互項(xiàng)中,L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量的影響極顯著。圖4直觀地反映了底物質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間的交互作用對GABA產(chǎn)量的影響。等高線沿發(fā)酵時間軸變化較L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度變化相對密集,曲面較陡,說明發(fā)酵時間的影響較顯著。

a-發(fā)酵時間和L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖;b-酵時間和L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度交互影響的等高線圖圖4 發(fā)酵時間和L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of ermentation time,L-glutamate concentration

對二次回歸方程分析,可得最優(yōu)的發(fā)酵條件為L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為12.73 g/L、屎腸球菌AB157和植物乳桿菌BC112的接種體積比為23∶17、發(fā)酵時間為84.47 h,該條件下GABA產(chǎn)量的理論預(yù)測為6.47 g/L。

2.3 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證和優(yōu)化

為了驗(yàn)證方程的準(zhǔn)確性,按照回歸方程的最優(yōu)值并根據(jù)實(shí)際應(yīng)用確定優(yōu)化條件為：L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度12.7 g/L、接種和發(fā)酵時間85 h。結(jié)果顯示,優(yōu)化條件下GABA的產(chǎn)量為6.35 g/L,與模型的預(yù)測值接近。且GABA產(chǎn)量與單菌發(fā)酵(1.60 g/L)相比,提高了3.9倍。

2.4 GAD酶活力分析結(jié)果

微生物合成GABA是通過GAD催化L-谷氨酸脫羧而成,因此GAD酶活力與GABA的產(chǎn)量密切相關(guān)。發(fā)酵過程中GAD酶活力分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 谷氨酸脫羧酶酶活力測定結(jié)果Fig.5 Activity of glutamic acid decarboxylase

在共培養(yǎng)發(fā)酵過程中,GAD酶活力明顯高于單菌發(fā)酵,48 h前酶活力的增長較為迅速,這一現(xiàn)象與共發(fā)酵時GABA產(chǎn)量和菌體增長數(shù)量的情況相一致。酶活力在48 h時達(dá)到最高,為1.223 U,此時GABA處于穩(wěn)定增長期；同時單菌的GAD酶活力為0.39 U。

表明共培養(yǎng)體系有利于提升GAD酶活力,可能是植物乳桿菌BC112的代謝物促進(jìn)屎腸球菌AB157生長,使谷氨酸脫羧酶高表達(dá),提高了GABA產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本研究對屎腸球菌AB157和植物乳桿菌BC112采用共培養(yǎng)提高GABA產(chǎn)量及關(guān)鍵酶GAD進(jìn)行分析。以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化共培養(yǎng)條件,在菌株接種量為4%,發(fā)酵溫度為30 ℃時,確定共培養(yǎng)條件為L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度12.7 g/L、屎腸球菌AB157與植物乳桿菌BC112接種體積比為5∶3、發(fā)酵時間85 h。在此優(yōu)化條件下,與單菌發(fā)酵相比,GABA生成量為6.35 g/L,產(chǎn)量提高3.9倍；同時,共培養(yǎng)GAD酶活力明顯高于單菌發(fā)酵。結(jié)果表明,共培養(yǎng)能顯著提高GABA的產(chǎn)量,但2株菌共培養(yǎng)高產(chǎn)GABA的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。