趙雨,郭建華,張春枝

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾,161006)2(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

磷脂酰絲氨酸是一類新資源食品,可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在酸奶、奶粉、面包、粉末飲料等食品中，具有增加腦突刺數(shù)目、提高腦細(xì)胞的流動(dòng)性及促進(jìn)腦細(xì)胞中葡萄糖代謝等功效,進(jìn)而預(yù)防及輔助治療阿爾茨默氏癥、抑郁癥等神經(jīng)性疾病[1]。由于磷酯酰絲氨酸具有重要的醫(yī)療保健功能,如何制備品質(zhì)高、價(jià)格低的磷酯酰絲氨酸產(chǎn)品是食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注方向。研究發(fā)現(xiàn),通過磷脂酶D生物轉(zhuǎn)化能夠生產(chǎn)高品質(zhì)磷脂酰絲氨酸。因此,磷脂酶D的高效獲得成為生物轉(zhuǎn)化合成磷酯酰絲氨酸的關(guān)鍵,已報(bào)道的產(chǎn)磷脂酶D的微生物種類主要有鏈霉菌[2]、棒狀桿菌[3]、大腸桿菌[4]、假單胞菌[5]、沙門氏桿菌[6]、蠟狀芽孢桿菌[7]、不動(dòng)桿菌[8]等。經(jīng)過菌株誘變、基因工程改造等方式,逐步提高了磷脂酶D活性,但目前仍然無法滿足磷酯酰絲氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的要求[9]。因此,如何獲得高活性磷脂酶D仍是實(shí)現(xiàn)磷酯酰絲氨酸生物合成的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)室前期在油廠附近的土壤中,篩選獲得1株產(chǎn)磷脂酶D的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)ZY12[10-11]。為確定發(fā)酵條件與產(chǎn)酶量的關(guān)系,進(jìn)一步提高菌株ZY12磷脂酶D酶活性,本研究對金屬離子、不同來源卵磷脂及小分子糖等多種化合物進(jìn)行篩選,并對培養(yǎng)溫度、pH等條件進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)而確定蠟狀芽孢桿菌ZY12的最佳產(chǎn)酶條件,為相似產(chǎn)酶菌株發(fā)酵條件的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

蠟狀芽孢桿菌ZY12分離自油廠附近土壤中,實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10,NaCl 5,酵母浸粉 5,調(diào)至pH至7。

蛋黃培養(yǎng)基IL(g/L)：蛋黃 10,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl21,調(diào)pH至7。

蛋白胨+葡萄糖+IL培養(yǎng)基PGIL(g/L)：蛋白胨 10,葡萄糖5,蛋黃 10,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl21,調(diào)pH至7。

蛋白胨+IL培養(yǎng)基PIL(g/L)：蛋白胨 10,蛋黃 10,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl21,調(diào)pH至7。

蛋白胨培養(yǎng)基PEP(g/L)：蛋白胨 10,CaCl21,MgSO4·7H2O 0.5,調(diào)pH至7。

卵磷脂+蛋白胨培養(yǎng)基PESO；PEPE；PEPS；PPC(g/L)：卵磷脂(大豆卵磷脂；花生卵磷脂；葵花卵磷脂；水溶性卵磷脂)5,蛋白胨 10,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl21,調(diào)pH至7。

糖類+PPC培養(yǎng)基GPPC；FPPC；MPPC(g/L)：糖類(葡萄糖、果糖、麥芽糖)5,蛋白胨 10,水溶性卵磷脂 5,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl21,調(diào)pH至7。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

取500 μL甘油管保藏的菌株ZY12加入50 mL IL培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

取1 mL培養(yǎng)24 h的種子液(接種量體積比2%)加入50 mL IL培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。

1.3.3 磷脂酶D活性測定

酶聯(lián)比色法[12]：反應(yīng)體系包括為100 μL PC乙醚(稱取0.5 g卵磷脂,加1 mL 乙醚,制成500 mg/mL的溶液,加水至10 mL,冰浴振蕩)、100 μL 酶液、100 μL 檸檬酸-檸檬酸鈉(0.1 mol/L,pH 6)、50 μL 0.1 mol/L CaCl2、150 μL 7.5% Triton X-100。37 ℃水浴搖床反應(yīng)10 min。沸水浴3 min 終止酶反應(yīng),冷卻至室溫,加入4 mL Tris-HCl溶液(包含2 mg 4-氨基安替比林、4 U 膽堿氧化酶、4 U 過氧化物酶、1 mg 苯酚和20 mg Triton X-100), 37 ℃水浴搖床反應(yīng)20 min,500 nm處測吸光值。

1.3.4 菌株ZY12磷脂酶D分布情況的測定

取10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min,離心后,上清液也為胞外酶液。

取10 mL發(fā)酵液于10 000 r/min離心20 min,離心后的菌體用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液洗滌3次,將洗凈的菌體重懸于10 mL PBS緩沖液中,超聲破碎,設(shè)置程序：功率300 W,模式為每超聲1 s間歇3 s,時(shí)間10 min。超聲時(shí)菌液處于冰浴中,保持低溫防止酶失活。破碎后處理?xiàng)l件與胞外酶相同,離心后上清液為胞內(nèi)酶液。離心后沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl 溶液洗滌3次,10 mL PBS緩沖液重懸,懸液為胞壁酶液。

1.3.5 pH對菌株ZY12產(chǎn)酶的影響

配制不同pH值的緩沖液,其中pH 5、6為檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液,pH 7、8、9為Tris-HCl緩沖液,pH 10為甘氨酸-NaOH緩沖液。在30 ℃條件下,菌體在上述緩沖液配制的蛋黃培養(yǎng)基中200 r/min搖床培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后,測定不同pH下磷脂酶D活性。

1.3.6 金屬離子對磷脂酶D活性的影響

向IL培養(yǎng)基中加入含有不同金屬離子的鹽,包括NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、BaCl2、FeCl3、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·H2O和MnSO4·H2O等,使得金屬離子的終濃度為2 mmol/L。在30 ℃條件下,菌體在添加了不同金屬離子的IL培養(yǎng)基(pH 7)中200 r/min搖床培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后,測定不同金屬離子存在下磷脂酶D活性。

向IL培養(yǎng)基中加入MgSO4·7H2O,使得金屬離子的終濃度為0.5、1、2、4、8、16 mmol/L,培養(yǎng)條件同上,培養(yǎng)結(jié)束后,測定不同濃度Mg2+存在下磷脂酶D活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟狀芽孢桿菌 ZY12培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)基組成對磷脂酶D活性和蠟狀芽孢桿菌ZY12細(xì)胞形態(tài)的影響

菌株ZY12在蛋黃為唯一碳氮源的平板中能夠產(chǎn)生透明圈,將該菌種培養(yǎng)在蛋黃為唯一碳氮源的液體培養(yǎng)基IL中,36 h發(fā)酵結(jié)束后,在胞外檢測到磷脂酶D活性,如圖1所示。

圖1 蛋黃培養(yǎng)基中胞外、胞壁、胞內(nèi)磷脂酶D活性對比Fig.1 Activity of PLD in different position of strain Bacillus cereus ZY12 growing in IL medium

由于IL培養(yǎng)基中蛋黃為唯一碳氮源,營養(yǎng)相對單一,可能影響菌體生長及產(chǎn)酶。因此將培養(yǎng)基更換為適合細(xì)菌生長的LB培養(yǎng)基,或在IL培養(yǎng)基中添加不同類型碳氮源,以期通過豐富培養(yǎng)基營養(yǎng)組分提高菌株的生物量及磷脂酶D活性。當(dāng)菌株ZY12在PGIL培養(yǎng)基、PIL培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)36 h后,胞外均檢測不到磷脂酶D活性。鏡檢結(jié)果顯示,菌株ZY12芽孢較小、菌體呈短桿狀,整體形態(tài)規(guī)則,未相互纏繞聚集。而培養(yǎng)在IL培養(yǎng)基具有磷脂酶D活性的菌株ZY12芽孢部分明顯突出、位于菌體中心,菌體形態(tài)較粗短,部分菌體相互連接成長鏈狀、纏繞聚集,如圖2所示。酶活性檢測結(jié)果表明,菌株ZY12只有在IL培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)方可檢測到磷脂酶D活性,當(dāng)培養(yǎng)基中不含蛋黃或除蛋黃外含有其他碳氮源時(shí),菌株ZY12無法檢測到磷脂酶D活性。由此推測蛋黃中某些成分能夠誘導(dǎo)菌株ZY12產(chǎn)生磷脂酶D。

圖2 不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件及菌體形態(tài)的差異Fig.2 The different of the Morphology of strain B.cereus ZY12 growing in different mediums

2.1.2 不同來源卵磷脂對蠟狀芽孢桿菌ZY12誘導(dǎo)產(chǎn)酶的影響

菌株ZY12在IL培養(yǎng)基中培養(yǎng)可檢測到磷脂酶D活性,蛋黃中比率最高的磷脂類物質(zhì)為卵磷脂(PC)[13],同時(shí)PC又是磷脂酶D的作用底物,因此推測出PC是誘導(dǎo)菌株ZY12產(chǎn)生磷脂酶D的關(guān)鍵物質(zhì)。在不同來源的PC培養(yǎng)基中[大豆卵磷脂(PESO)、花生卵磷脂(PEPE)、葵花卵磷脂(PEPS)、水溶性卵磷脂中(PPC)],菌株ZY12發(fā)酵培養(yǎng)36 h后,均能檢測到磷脂酶D活性,如圖3所示。不同來源PC均能夠誘導(dǎo)菌株ZY12產(chǎn)磷脂酶D,但在IL培養(yǎng)基中發(fā)酵的菌體酶活性最高。推測是由于蛋黃中卵磷脂具有更好的水溶性及細(xì)胞膜穿透性,因此在蛋黃卵磷脂的誘導(dǎo)下,菌株ZY12磷脂酶D活性更高。

圖3 不同來源卵磷脂對磷脂酶D活性的影響Fig.3 PLD activities of strain B.cereus ZY12 growing in different PC mediums

2.1.3 小分子糖在PPC培養(yǎng)基中對蠟狀芽孢桿菌ZY12產(chǎn)酶的影響

前期試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)IL培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí),菌株無磷脂酶D活性。為檢測不同小分子糖對菌株ZY12產(chǎn)磷脂酶D的影響,采用成分單一的水溶性卵磷脂作為培養(yǎng)基(PPC)主要成分,通過添加葡萄糖、果糖、麥芽糖,檢測ZY12在培養(yǎng)基GPPC、FPPC、MPPC中發(fā)酵培養(yǎng)36 h后磷脂酶D活性。由圖4可知,只有在未添加小分子糖類物質(zhì)的PPC培養(yǎng)基中,菌株ZY12發(fā)酵結(jié)束后才具有磷脂酶D活性。當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖、果糖以及麥芽糖等小分子糖類時(shí),卵磷脂的誘導(dǎo)作用均被抑制,在胞外檢測不到磷脂酶D活性。結(jié)果證實(shí)某些碳源(如葡萄糖、果糖、麥芽糖)會(huì)抑制磷脂酶D的表達(dá)。目前,文獻(xiàn)中篩選磷脂酶D產(chǎn)生菌所用的培養(yǎng)基中均添加有小分子糖[14-17],這種篩選方法會(huì)阻礙誘導(dǎo)型磷脂酶D產(chǎn)生菌的獲得。即使培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物,但與葡萄糖、果糖或麥芽糖等碳源同時(shí)存在時(shí),誘導(dǎo)物不能產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,進(jìn)而限制產(chǎn)磷脂酶D菌株的獲得。

圖4 水溶性卵磷脂培養(yǎng)基中不同碳源對磷脂酶D活性的影響Fig.4 PLD activities of strain B.cereus ZY12 growing in water-soluble PC with different carbon sources mediums

2.1.4 蛋黃質(zhì)量濃度對蠟狀芽孢桿菌ZY12產(chǎn)酶的影響

蛋黃做為唯一碳氮源能夠使菌株ZY12產(chǎn)生更高的磷脂酶D活性,將菌株ZY12培養(yǎng)在不同蛋黃質(zhì)量濃度(1、5、10、15、20、25、30 g/L)下的IL培養(yǎng)基中,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)36 h,測定胞外磷脂酶D活性。如圖5所示,蛋黃質(zhì)量濃度在10～30 g/L,磷脂酶D活性無顯著差異,由于在吸取蛋黃過程中,可能混入少量蛋清,且存在一定誤差,因此選擇20 g/L,進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

圖5 蛋黃濃度對磷脂酶D活性的影響Fig.5 Effects of different yolk concentration on PLD activities of strain B.cereus ZY12 adding in IL medium

2.2 pH、溫度對蠟狀芽孢桿菌ZY12產(chǎn)酶的影響

2.2.1 pH對蠟狀芽孢桿菌ZY12產(chǎn)酶的影響

如圖6所示,當(dāng)pH介于6～8之間時(shí),酶活性較高；pH為8時(shí),酶活性最高；隨著pH繼續(xù)增大,酶活性急劇下降。通常情況下,芽孢桿菌屬的菌體對pH有較強(qiáng)的耐受能力,不會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)酶能力急劇下降的現(xiàn)象。但菌株ZY12所處環(huán)境pH大于8后,酶活性急劇下降,可能是由于堿性條件下,ZY12產(chǎn)生的磷脂酶D水解活性增強(qiáng),菌體生存環(huán)境進(jìn)一步惡化,導(dǎo)致了菌體在較高pH值環(huán)境下耐受性降低、產(chǎn)酶量下降。由于在菌株ZY12發(fā)酵中,某些代謝產(chǎn)物會(huì)改變培養(yǎng)環(huán)境的pH,為防止培養(yǎng)環(huán)境堿性化后酶活性的急劇下降,因此,發(fā)酵過程中pH最終確定為7。

2.2.2 溫度對蠟狀芽孢桿菌ZY12產(chǎn)酶的影響

在pH 7的條件下,30 ℃時(shí)的酶活性最高；隨著溫度的升高,酶活性下降并不顯著(圖6),說明菌體對溫度的耐受能力較強(qiáng)。依據(jù)上述結(jié)果,將菌株ZY12培養(yǎng)在pH為7的蛋黃培養(yǎng)基中,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)36 h后可在發(fā)酵液中獲得較高的磷脂酶D活性。

圖6 蛋黃培養(yǎng)基中不同pH、溫度條件下產(chǎn)酶曲線Fig.6 Effects of pH and temperature on PLD activities of strain B.cereus ZY12 growing in IL medium

2.3 金屬離子對蠟狀芽孢桿菌ZY12磷脂酶D活性的影響

多數(shù)磷脂酶D產(chǎn)生活性時(shí)需要Ca2+的參與,同時(shí)部分二價(jià)離子能夠提高磷脂酶D活性[18]。如圖7所示,通過在培養(yǎng)基中添加不同單一金屬離子,發(fā)現(xiàn)在添加了Mg2+、Na+、Ca2+的發(fā)酵液中均能夠檢測到磷脂酶D活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同金屬離子增加磷脂酶D催化活性強(qiáng)度如下：Mg2+>Ca2+>Na+>(二價(jià)金屬離子、Fe3+無催化活性)。

圖7 蛋黃培養(yǎng)中添加不同金屬離子對磷脂酶D活性的影響Fig.7 Effects of different metal ions on PLD activities of strain B.cereus ZY12 adding in IL medium

為確定金屬離子添加最優(yōu)配比,將以上3種離子(Mg2+、Na+、Ca2+)分別添加到最初實(shí)驗(yàn)中測試的單一離子(Mg2+、Na+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+)中,確定最優(yōu)組合。結(jié)果顯示,任何離子與Ca2+共同添加在培養(yǎng)基中,菌株磷脂酶D活性與單一Ca2+接近；除Ca2+外,Mg2+與其他金屬離子共同添加的培養(yǎng)基中的磷脂酶D活性與單一Mg2+接近且活性最高。而Na+只能增加Fe3+培養(yǎng)基中酶活性使其與添加單一Na+的磷脂酶D活性相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同金屬離子與磷脂酶D的結(jié)合有強(qiáng)弱差別,結(jié)合強(qiáng)度依次為：Ca2+>Mg2+>二價(jià)金屬離子>Na+>Fe3+。雖然Mg2+能夠使磷脂酶D具有更高的催化活性,但磷脂酶D優(yōu)先與催化活性低于Mg2+的Ca2+結(jié)合,并表現(xiàn)出單一Ca2+參與的催化活性。這一結(jié)果與多數(shù)磷脂酶D表現(xiàn)出的Ca2+添加后催化活性最高的研究結(jié)果不同。菌株ZY12產(chǎn)生的磷脂酶D添加Ca2+后,具有催化活性,但酶活性低于添加Mg2+后的磷脂酶D。因此在培養(yǎng)基中填加單一Mg2+能夠獲得更高的酶活性,共同添加其他金屬離子對酶活性無正向影響。在培養(yǎng)基中添加不同濃度單一Mg2+,結(jié)果如圖8所示,Mg2+添加濃度為2 mmol/L時(shí),磷脂酶D活性最大。

圖8 Mg2+濃度對磷脂酶D活性的影響Fig.8 Effects of different Mg2+concentration on PLD activities of strain B.cereus ZY12 adding in IL medium

3 結(jié)論

本文以前期篩選到的產(chǎn)磷脂酶D的蠟狀芽孢桿菌ZY12出發(fā),通過單因素試驗(yàn),確定了菌株ZY12最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：20 g/L蛋黃、2 mmol/L MgSO4·7 H2O、pH為7、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間36 h,磷脂酶D活性最高。菌株ZY12能夠在蛋黃、大豆卵磷脂、花生卵磷脂、葵花卵磷脂、水溶性卵磷脂的誘導(dǎo)下產(chǎn)生磷脂酶D,但當(dāng)培養(yǎng)基中添加葡萄糖、果糖、麥芽糖則會(huì)抑制磷脂酶D的產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)研究表明,Mg2+的添加能夠使菌株具有更高的磷脂酶D活性,但共同添加Ca2+會(huì)降低酶活性。說明菌株ZY12產(chǎn)生的磷脂酶D與前期研究的其他類型磷脂酶D在催化離子的種類選擇上有較大差別。菌株ZY12只有在特定物質(zhì)誘導(dǎo),且無小分子糖存在的條件下,才能產(chǎn)生磷脂酶D。但目前文獻(xiàn)中關(guān)于篩選磷脂酶D產(chǎn)生菌所用培養(yǎng)基,均添加有小分子糖類[14-17]。由于小分子糖類會(huì)抑制誘導(dǎo)型磷脂酶D的產(chǎn)生,導(dǎo)致篩選過程中,許多誘導(dǎo)型磷脂酶D產(chǎn)生菌被遺漏,造成篩選結(jié)果單一,阻礙了高效磷脂酶D產(chǎn)生菌的獲得。通過本研究確定了一種新型的篩選培養(yǎng)基,能夠篩選獲得某些誘導(dǎo)型磷脂酶D產(chǎn)生菌,為磷脂酶產(chǎn)生菌的篩選提供理論基礎(chǔ)及方法創(chuàng)新。