王曉玲,范曉艷,趙俊龍,劉麗華,李惠

(1.渭南市中心醫(yī)院,渭南 714000;2.陜西省康復(fù)醫(yī)院,西安 710065;3.成都市溫江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,成都 611130)

骨骼肌約占體質(zhì)量的 40%,在氨基酸和葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮作用,骨骼肌的神經(jīng)支配在決定肌肉結(jié)構(gòu)和功能方面起著至關(guān)重要的作用[1]。失神經(jīng)不僅導(dǎo)致肌肉萎縮和復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng),而且預(yù)后很差,甚至?xí)黾铀劳雎省Ｍ耆窠?jīng)后,骨骼肌沒有收縮活動(dòng),肌肉纖維迅速萎縮,肌肉質(zhì)量喪失,導(dǎo)致功能受損[2]。研究認(rèn)為萎縮肌肉中自噬負(fù)責(zé)在溶酶體中降解所有活細(xì)胞中不必要的或功能失調(diào)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),由此產(chǎn)生的分解產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生新的能量來維持細(xì)胞和組織的健康[3]。電刺激、伸展和強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)等,被廣泛用于神經(jīng)再支配發(fā)生之前防止失神經(jīng)肌肉萎縮[4]。電針作為有效緩解失神經(jīng)骨骼肌萎縮的一種方法,被認(rèn)為可有效促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)及改善神經(jīng)損傷的癥狀[5]。因此,本研究探討電針對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠自噬相關(guān)因子的影響,以期為失神經(jīng)骨骼肌萎縮治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量(260±10)g,8周齡,購自成都碩達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2019-031,使用許可證號(hào) SYXK(川)2018-119。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組,每組10只。

1.2 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒(上海碧云天生物),蛋白裂解試劑盒(江蘇凱基生物),PCR引物(上海生工),RNA Miniprep試劑盒(上海西寶生物),總RNA提取試劑(北京天根),p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1抗體(英國Abcam),華佗牌電針儀SDZ-V型(蘇州醫(yī)療用品廠),凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.3 模型制備

通過暴露并切斷坐骨神經(jīng)的方法制作失神經(jīng)性腓腸肌萎縮動(dòng)物模型。具體方法[6]為采用2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠固定,充分暴露大鼠右后肢,使用已高壓消毒的手術(shù)器械沿臀大肌間隙鈍性分離、暴露坐骨神經(jīng),剝離坐骨神經(jīng)后,用手術(shù)剪將模型組與電針組的大鼠坐骨神經(jīng)中段切斷,同時(shí)使兩游離段反折產(chǎn)生2.0 mm的神經(jīng)缺損,而假手術(shù)組只暴露但不切斷坐骨神經(jīng)。

1.4 電針干預(yù)

造模后第2天開始,每日9: 00將電針組的大鼠固定于柔軟型大鼠固定器上,電針術(shù)側(cè)足三里、承山兩穴,針刺深度為5～7 mm,每日1次,每次10 min。穴位定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》以及李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7];電針參數(shù)參考文獻(xiàn)[8],強(qiáng)度1.5 mA疏波,頻率為 5 Hz,以大鼠下肢稍震動(dòng)為宜。為了避免強(qiáng)制固定時(shí)所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)誤差,假手術(shù)組和模型組每日只固定不做任何處理,連續(xù)21 d。

1.5 樣本采集

實(shí)驗(yàn)過程中,電針組大鼠死亡2只,模型組和假手術(shù)組未出現(xiàn)死亡,樣本采集過程中模型組和假手術(shù)組隨機(jī)剔除 2只大鼠,樣本均按每組8只采集分析。經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)將大鼠麻醉,迅速剝離雙側(cè)腓腸肌,稱重,保留術(shù)側(cè)腓腸肌,迅速采用 PBS緩沖液沖洗后,分 2部分,一部分采用多聚甲醛,一部分﹣80 ℃冰箱保存,待測。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 各組大鼠腓腸肌濕重比計(jì)算

取材時(shí)用電子天平稱重并記錄雙側(cè)腓腸肌濕重,計(jì)算腓腸肌濕重比為(術(shù)側(cè)肌濕重/健側(cè)肌濕重)×100%。

1.6.2 腓腸肌組織病理觀察

HE染色,腓腸肌組織石蠟包埋,切片(約3～5 μm),脫水,蘇木精染色,后用伊紅染色,然后用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性橡膠密封,顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。Masson染色,常規(guī)石蠟切片脫蠟至水洗,酸性高錳酸鉀氧化,沖洗,草酸漂白,沖洗后放入蒸餾水中洗滌,用變色酸2R試劑染色,冰醋酸洗滌,磷鎢酸分化,傾去余液放入 1%～2%苯胺藍(lán)染色,再用冰醋酸水洗滌,封片,鏡檢觀察。

1.6.3 Western blot檢測

采用裂解試劑盒從腓腸肌中提取蛋白,總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,用5%的脫脂牛奶溶于 Tris-Buffered生理鹽水(TBS)進(jìn)行封閉。將膜與下列一抗在4 ℃下孵育過夜,p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1(均1:1 000)。經(jīng)3次洗滌后,在37 ℃孵育2 h,用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體孵育。取出聚偏氟乙烯膜,化學(xué)發(fā)光法獲得膠片后進(jìn)行圖像采集,目標(biāo)條帶A值采用Quantity One凝膠圖像軟件分析,結(jié)果以p62、Beclin-1與β-actin INT值的比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ INT值的比值進(jìn)行分析。

1.6.4 qRT-PCR檢測

采用總 RNA Miniprep試劑盒從腓腸肌中提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,采用TaqMan miRNA檢測試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR。以 GAPDH 作為內(nèi)參,用 2-??CT分析相關(guān)基因表達(dá)。qPCR引物為Beclin-1,正向5'-GCTCCT ATTCCATCAAAACCCA-3',反向 5'-GTGAGGACACCCAAGCAA GAC-3';Vps34,正向5'-GAAAATATGGCATGTT TCGCC-3',反向5'-GTTCGTGTGGGTTCGGAGC-3';LC3,正向5'-AGAG CGATACAAGGGTGAGAAGC-3',反向 5'-CAGGAGGAAGAAGGC TTGGTTAG-3';GAPDH,正向5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTC GTAT-3',反向5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腓腸肌濕重比變化

與假手術(shù)組相比,模型組腓腸肌濕重比明顯降低(P＜0.01);與模型組相比,電針組的腓腸肌濕重比明顯升高(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠腓腸肌濕重比變化

2.2 各組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色,假手術(shù)組肌肉組織內(nèi)肌纖維排列較整齊,肌束結(jié)構(gòu)較清晰,呈扁圓形或橢圓形,核位于邊緣,肌纖維胞質(zhì)染色較均勻;肌間可見豐富的血管、神經(jīng)等分布;局部肌纖維排列較稀疏,肌束大小不一,未見明顯纖維組織增生。模型組肌肉組織內(nèi)部分肌纖維嚴(yán)重萎縮變形,體積變小,細(xì)胞壞死或溶解;肌間較多纖維組織增生。電針組肌肉組織內(nèi)少量肌纖維輕微萎縮;肌間少量纖維組織增生(圖1)。

Masson染色,假手術(shù)組腓腸肌肌纖維排列整齊且形態(tài)較規(guī)則,并無明顯萎縮。模型組與電針組術(shù)側(cè)腓腸肌萎縮明顯,其形態(tài)較假手術(shù)組明顯縮小,膠原纖維逐漸增多且肌纖維間距因膠原纖維的增生而變寬。但電針組與模型組相比,腓腸肌萎縮明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.3 各組大鼠腓腸肌組織 p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組 p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白水平升高(P＜0.05,P＜0.01);與模型組比較,電針組 Beclin-1蛋白水平降低(P＜0.05),p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平無明顯變化(P＞0.05)(圖2)。

圖2 各組大鼠腓腸肌組織p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1水平

2.4 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平升高(P＜0.05,P＜0.01);與模型組比較,電針組Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平降低(P＜0.05)。詳見表2。

表 2 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較 (±s)

表 2 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.05

組別 n Beclin-1 Vps34 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ假手術(shù)組 8 1.01±0.19 1.01±0.13 1.00±0.09模型組 8 1.54±0.211) 1.97±0.422) 1.46±0.152)電針組 8 1.17±0.103) 1.39±0.173) 1.18±0.133)

3 討論

失神經(jīng)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降,肌肉纖維橫截面積減少,肌力產(chǎn)生減少,肌周和肌內(nèi)結(jié)締組織增多,這一階段之后是進(jìn)行性的肌肉纖維壞死和凋亡,肌肉被纖維結(jié)締組織和脂肪取代[9]。通過加速目標(biāo)肌肉的軸突再生和減緩萎縮的進(jìn)程,從而提高肌肉的功能,可以改善神經(jīng)損傷和修復(fù)后的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。研究指出神經(jīng)修復(fù)后在神經(jīng)再生過程中進(jìn)行肌肉電刺激可以最大限度地減少失神經(jīng)期間的肌肉萎縮[10]。在失神經(jīng)肌肉中使用電刺激治療,結(jié)締組織含量減少,肌肉纖維面積增加[11]。此外,電刺激可明顯改善肌肉機(jī)械性能[12]。本研究結(jié)果顯示,電針組的腓腸肌濕重比明顯高于模型組,電針組肌肉組織內(nèi)少量肌纖維輕微萎縮,肌間少量纖維組織增生,腓腸肌萎縮明顯低于模型組。與上述報(bào)道一致,表明電針可以有效延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮進(jìn)程。

自噬是細(xì)胞降解、自我消化及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制。通過自噬選擇性地處理有缺陷的細(xì)胞成分可以在衰老過程中保護(hù)許多組織的細(xì)胞功能[13]。肌纖維萎縮的典型原因是蛋白質(zhì)合成減少和蛋白質(zhì)降解增加,這主要是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性和自噬決定的[14]。骨骼肌中自噬的過度活化會(huì)加重肌肉萎縮,但抑制自噬會(huì)導(dǎo)致肌肉無力、萎縮、肌纖維變性,在去神經(jīng)時(shí)抑制自噬會(huì)加劇肌肉質(zhì)量損失,受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的積累從而影響組織的維持。自噬在幼鼠肌肉中的誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致肌纖維萎縮,肌肉質(zhì)量下降,肌肉力量成比例下降[15]。此外,趙偉等[16]報(bào)道提示電針可能通過促進(jìn)自噬來延緩肌萎縮。自噬相關(guān)基因Beclin-1能介導(dǎo)其他自噬蛋白質(zhì)定位于自噬前體,Vps34可與Beclin1、Vps15形成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合物,在自噬體形成早期發(fā)揮重要的作用[17]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ被認(rèn)為是檢測自噬的重要指標(biāo)之一,LC3參與了自噬體膜的形成,細(xì)胞內(nèi)LC3經(jīng)過Atg4加工成為胞漿可溶形式LC3Ⅰ,LC3Ⅰ再經(jīng)Atg3、Atg7的作用,與自噬體膜上的PE結(jié)合成為 LC3Ⅱ,促進(jìn)了自噬體膜的延伸,可追蹤自噬的整個(gè)過程,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以反映出自噬的活性[18]。研究[17]發(fā)現(xiàn)亮氨酸的抗萎縮作用依賴于 Vps34活性,文獻(xiàn)[19]報(bào)道電針干預(yù)可能通過抑制自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5等表達(dá),從而維持骨骼肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài),延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮。此外,研究[18]發(fā)現(xiàn)CSRP3沉默可抑制自噬相關(guān)LC3和Beclin-1蛋白的積累,從而使成肌細(xì)胞自噬受損。本研究表明模型組p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 蛋白水平及 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA表達(dá)較假手術(shù)組升高,電針組Beclin-1蛋白水平及Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA表達(dá)較模型組降低。研究結(jié)果與文獻(xiàn)[16]報(bào)道不一致,可能是由于自噬的過度激活會(huì)造成肌肉萎縮,研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致,說明自噬活性在大鼠失神經(jīng)后升高,肌肉在早期可能進(jìn)行自我修復(fù),電針干預(yù)后促進(jìn)細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)的作用下降,抑制自噬過度激活。

綜上,電針可改善失神經(jīng)骨骼肌萎縮程度,下調(diào)自噬相關(guān)因子 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá),自噬可能為電針延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮進(jìn)程機(jī)制之一。