李國祥潘 玥胡 鵬杜廷福馬開利*

(1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所 藥物安全性評價研究中心,昆明 650118；2.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學靈長類研究中心&神經(jīng)科學中心,北京 100005)

帕金森病(Parkinson,s disease,PD)是第二大常見神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡及α-突觸核蛋白的聚集[1]。然而,α-突觸核蛋白在PD 中確切的功能尚未完全研究清楚。 動物模型無疑是研究蛋白質(zhì)功能及PD發(fā)病機理的一個重要工具,目前迫切地需要一些動物模型去探究α-突觸核蛋白確切的生理功能及進行藥物研發(fā)的評估。 盡管已經(jīng)開發(fā)出許多模型,如毒素模型和轉(zhuǎn)基因動物模型,部分能表現(xiàn)出黑質(zhì)及紋狀體多巴胺能神經(jīng)元減少或多巴胺(dopamine,DA)水平降低以及行為障礙[2-6],表明α-突觸核蛋白的積累可以顯著影響DA 能神經(jīng)元的功能,但在大多數(shù)小鼠中都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的黑質(zhì)及紋狀體變性[7-9],不能完美地再現(xiàn)PD 的病理特征[10],給PD的研究帶來了困擾。

在最近的研究中,有學者嘗試用rAAV 在成年鼠中以腦立體定位注射的方式構(gòu)建α-突觸核蛋白局部過表達動物模型,能初步重現(xiàn)PD 的原發(fā)性運動障礙及部分多巴胺能神經(jīng)元損傷[11-14],表明rAAV 可以作為一種快速靶向的動物模型建立的工具,然而靶向和局部α-突觸核蛋白過表達有一定的局限性,局部注射的rAAV 只在部分腦區(qū)傳導(dǎo)表達,而PD 的發(fā)生發(fā)展可能由多個腦區(qū)的共同參與。 最近研究表明,可以通過向胎鼠或乳鼠腦室內(nèi)注射rAAV 來實現(xiàn)整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達[15-18],與成年鼠注射病毒相比,這種方法可實現(xiàn)更有效的擴散和感染,且表達在注射后數(shù)天內(nèi)開始,并持續(xù)于動物的整個生命周期[19-21]。 且有報道稱rAAV2/9 能跨越血腦屏障,表現(xiàn)出在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛傳導(dǎo)的能力[22],并能感染新生神經(jīng)元[21,23]。 此外,人源SNCA(hSNCA)轉(zhuǎn)基因小鼠模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用和認可,人源α-突觸核蛋白在小鼠中并不會引起強烈的免疫排斥反應(yīng)而被清除,可長期表達存在[5-6,24]。 因此,本文旨在通過對新生乳鼠ICV 注射攜帶人源的SNCA-EGFP基因或EGFP的rAAV2/9,快速高效地構(gòu)建腦中廣泛表達α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)基因模型,并初步探究α-突觸核蛋白過表達對小鼠腦的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠30 只,8 周齡,體重20 ～22 g,雌雄2 ∶1,由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所小動物部提供[SCXK(滇)K2019-0002]。 動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所藥物安全性評價研究中心20℃～24℃的屏障環(huán)境中[SYXK(滇)K2018-0006],自由進水和進食,采用晝夜12 h 間斷照明。 在實驗前以雌雄2 ∶1的比例合籠,見栓后把母鼠分離單獨飼養(yǎng)。 給予充足的食物和水源,在母鼠妊娠后第1 天(postnatal day,P0)進行病毒注射并標記后繼續(xù)給予充足的食物和水源飼養(yǎng)。 實驗經(jīng)本單位倫理委員會審核批準(DWSP202012008),實驗過程按實驗動物使用的3R 原則給予動物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提取試劑盒( 貨號:CW2106S)、BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:CW0014S)購自康為科技有限公司；只與人源α-突觸核蛋白反應(yīng)的兔多克隆抗體α-synuclein(MJFR1) (貨號:ab138501)、NeuN 鼠單克隆抗體(貨號:ab104224)、DAPI(貨號:ab104139)購自英國abcam；GFAP 鼠單克隆抗體(貨號:Cat# G3893)及固綠(貨號:F7252)購自美國Sigma；Iba 1 兔多克隆抗體(貨號:016-20001)購自日本wako；抗聚集性α-synuclein(5G4)單克隆抗體(貨號:MABN389)購自美國Merck；鼠α-synuclein 單克隆抗體(貨號:610786)購自美國BD；兔來源TH 多克隆抗體(貨號:PA5-85167)購自美國Invitrogen；GAPDH 單克隆抗體(貨號:60004-1)購自美國Proteintech；594 波長免疫熒光兔二抗(貨號:A11012)及488 波長鼠二抗(貨號:A11001)購自美國Invitrogen；Western blot 兔源熒光二抗(貨號:926-32211)及鼠源熒光二抗(貨號:926-32210)購自 美 國 Li-cor； 免 疫 組 化 試 劑 盒( 貨 號:GK5000705)購自上?；蚩萍?；微量注射器購自瑞士Hamilton。

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝

pAAV-hSyn-EGFP、 pAAV-hSyn-SNCA-PGK-EGFP質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建和保存。 兩種質(zhì)粒在大腸桿菌中擴增后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA 并鑒定。 攜帶人源SNCA-EGFP及EGFP的重組腺相關(guān)病毒rAAV2/9 由泰爾圖公司包裝并純化,其病毒滴度約為1.5×1013GC/mL,凍存在-80℃冰箱中待用。

1.3.2 新生乳鼠側(cè)腦室注射

在注射前把注射針頭、鑷子和剪刀高壓滅菌。取1.5 μL 病毒與0.5 μL 的固綠混合,充分混勻并置于冰上,固綠用于標記注射位點。 出生后第1 天(P0)的乳鼠與母鼠分離,置于冰上2～3 min 充分麻醉,用5 μL Hamilton 微量注射器注射小鼠側(cè)腦室,進針深度為3 mm,注射速度約為1 μL/min,每側(cè)注射1 μL,注射后留針1 min。 注射結(jié)束時擦拭75%乙醇并標記后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)2 周或3 個月進行解剖檢測。

1.3.3 Western blot

處死小鼠取腦并分離各個腦區(qū)置于冰冷的EP管中,加入適量的RIPA 裂解后,取上清用BCA 試劑盒進行蛋白定量,之后加5×上樣緩沖液進行煮沸5 min 待用。 配置SDS-PAGE 膠,上樣,85 V 電壓跑膠120 min 后,用半干轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉45 min 后,抗體孵育4℃過夜,TBS 洗膜5min×3 次后,用羊抗鼠或抗兔的Western blot 熒光二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次后,Odyssey 紅外激光掃描系統(tǒng)進行顯影拍照。

1.3.4 免疫熒光

用多聚甲醛對2 周或3 個月的rAAV2/9 ICV 注射小鼠進行灌注,取腦后用多聚甲醛固定24 ～36 h,脫水機脫水處理,包埋后切片厚度為4 μm。 切好的片子65℃孵箱烤片,常規(guī)脫蠟水化,蒸餾水沖洗,PBS 浸泡5 min,Tris-EDTA 緩沖液微波爐煮沸進行抗原修復(fù)15 min,蒸餾水浸泡5 min,正常山羊血清室溫封閉1 h 后,滴加相應(yīng)稀釋好的一抗4℃過夜,PBS 洗5 min×3 次,后滴加鼠或者兔來源的熒光二抗,DAPI 封片后用Panoramic MIDI 獲取圖片。

1.3.5 免疫組化

多聚甲醛對2 周或3 個月的rAAV2/9 ICV 注射小鼠進行灌注,取腦后用甲醛固定24 ～36 h,脫水機脫水處理,包埋后切片厚度為4 μm。 切好的片子65℃孵箱烤片,常規(guī)脫蠟水化,蒸餾水沖洗,PBS 浸泡5 min,用Tris-EDTA 緩沖液微波爐煮沸進行抗原修復(fù)15 min,蒸餾水浸泡5 min,3%過氧化氫孵育30min 去除內(nèi)源性過氧化氫酶,正常山羊血清室溫封閉1 h 后,滴加抗α-synuclein(MJFR1)兔多克隆抗體及Iba 1 兔多克隆抗體,4℃過夜。 PBS 洗5 min×3 次,滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1.5 h,PBS 洗5 min×3 次,新鮮配置的DAB 顯色液。蘇木素復(fù)染3 min,鹽酸乙醇脫色,氨水返藍,梯度乙醇及二甲苯脫水,樹膠封片,用Panoramic MIDI 獲取圖片。

2 結(jié)果

2.1 新生乳鼠側(cè)腦室rAAV2/9 注射構(gòu)建hSNCA轉(zhuǎn)基因模型

為了高效構(gòu)建一種hSNCA轉(zhuǎn)基因鼠模型,我們按照如圖1A 上所示方法對新生乳鼠側(cè)腦室注射rAAV2/9。 在注射后,病毒擴散到各個腦室中(圖1 A 下),表明注射位點是準確的。 兩周后,用只與人源α-突觸核蛋白反應(yīng)的Anti-α-synuclein(MJFR1)抗體進行免疫熒光染色檢測α-突觸核蛋白在整個腦區(qū)的表達水平。 結(jié)果如圖1B 所示,在對照組AAV-EGFP 中,未出現(xiàn)α-突觸核蛋白陽性染色,表明抗體的特異性良好,不會與鼠源α-突觸核蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),而在實驗組AAV-SNCA 中,檢測到α-突觸核蛋白廣泛表達在轉(zhuǎn)基因鼠的各個腦區(qū)。 為了驗證這個結(jié)果,采用Western blot 分別檢測2 周(圖1C)及3 個月(圖1D)年齡的鼠嗅球(olfactory bulb, OB)、 皮 層(cerebral cortex, CTX)、 海 馬(hippocampus, hip)、 間 腦(interbrain, IB), 中 腦(middle brain,Mid),小腦(cerebellum,CB),后腦(hindbrain,HB)中α-突觸核蛋白的表達,結(jié)果顯示α-突觸核蛋白在各個腦區(qū)中均表達,其中在小腦中表達量稍低,與免疫熒光結(jié)果一致。 這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因鼠構(gòu)建成功,且α-突觸核蛋白廣泛持久地表達(2 周～3 個月),人源α-突觸核蛋白并未發(fā)生強烈的免疫排斥反應(yīng)而被清除。

2.2 ICV 注射rAAV2/9 后α-突觸核蛋白在全腦廣泛表達

為了進一步探究轉(zhuǎn)基因鼠中α-突觸核蛋白的表達模式,用α-突觸核蛋白特異性抗體的免疫組織化學染色檢測2 周齡鼠嗅球(olfactory bulb,OB)、皮層(cerebral cortex,CTX)、海馬(hippocampus,Hip)、間腦(interbrain,IB)、中腦(middle brain,Mid)和小腦(cerebellum,CB)中α-突觸核蛋白的表達。 結(jié)果顯示,α-突觸核蛋白在嗅球中高表達(圖2A),少部分分布在胞核中。 在大腦皮層處(圖2B),α-突觸核蛋白高表達并主要分布在胞質(zhì)中,而在海馬的CA2/3 區(qū)(圖2C),α-突觸核蛋白廣泛分布在顆粒細胞層的胞質(zhì)及胞核中。 在間腦中(圖2D),α-突觸核蛋白廣泛分布在丘腦及下丘腦中。 在中腦(圖2E)中,α-突觸核蛋白亦高表達,并主要在胞質(zhì)中。 有趣的是,α-突觸核蛋白特異性地表達在小腦的浦肯野細胞中(圖2F)。

2.3 ICV 注射rAAV2/9 后α-突觸核蛋白的表達定位

蛋白質(zhì)的表達定位往往與其特定的功能相關(guān),我們通過免疫熒光檢測2 周齡鼠中人源α-突觸核蛋白的亞細胞定位。 結(jié)果顯示,在多巴胺能神經(jīng)元(TH+神經(jīng)元)中,α-突觸核蛋白高表達,且其主要表達于神經(jīng)元胞質(zhì)中(圖3A)。 在其它腦區(qū),如圖3B所示,嗅球及皮層中有少部分α-突觸核蛋白表達在胞核中,而在海馬的CA2/3 區(qū),少數(shù)顆粒細胞的胞核中出現(xiàn)α-突觸核蛋白核定位的現(xiàn)象,在小腦處,α-突觸核蛋白在浦肯野細胞核中高表達,其結(jié)果與圖2F 一致。

注:A:新生乳鼠注射方式模式圖；B:2 周齡鼠α-突觸核蛋白的免疫熒光染色；C:Western blot 檢測2 周齡鼠腦中人源及總的α-突觸核蛋白(人+鼠)在對照及轉(zhuǎn)基因小鼠各個腦區(qū)的表達；D:Western blot 檢測3 月齡鼠腦中人源及總的α-突觸核蛋白(人+鼠)在對照及轉(zhuǎn)基因小鼠各個腦區(qū)的表達。 GAPDH 作為內(nèi)參。圖1 SNCA 轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建Note. A, Cartoon describes the surgical approach for ICV injection in neonatal mouse brains. B, Immunofluorescence stain reveals the expression of αsynuclein in the whole brain at 2 weeks. C,Level of human and total α-synuclein expression in the transgene was assessed by Western blot at 2 weeks.D, Level of human and total α-synuclein expression in the transgene were assessed by Western blot at 3 months. GAPDH was used as an internal control.Figure 1 Construction of SNCA transgenic mice

2.4 ICV 注射rAAV2/9 后誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞增生

大量的研究表明PD 的發(fā)生可能與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。 于是,通過免疫熒光檢測3 月齡轉(zhuǎn)基因鼠腦中星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量(GFAP+細胞),如圖4A所示,在黑質(zhì)(Substantia nigra,SN)中,α-突觸核蛋白廣泛表達的區(qū)域出現(xiàn)星形膠質(zhì)增生的現(xiàn)象,而在海馬中(圖4B)得到了同樣的結(jié)果,GFAP+膠質(zhì)細胞也顯著地增生。 此外,免疫組化染色檢測的小膠質(zhì)細胞在海馬(圖4C)及皮層(圖4D)也顯著增生。

注:免疫組化分析2 周齡鼠人源α-突觸核蛋白在各個腦區(qū)中的表達。 A:嗅球(OB)；B:皮層(CTX)；C:海馬(Hip)；D:間腦(IB)；E:中腦(Mid)；F:小腦(CB)。 后圖為局部放大圖。圖2 轉(zhuǎn)基因鼠中α-突觸核蛋白在各個腦區(qū)中廣泛表達Note. Level and distribution of human α-synuclein expression were evaluated histologically. A, Olfactory bulb(OB). B, Cerebral cortex(CTX). C,Hippocampus(Hip). D, Interbrain(IB). E, Middle brain(Mid). F, CB Cerebellum(CB). A partial enlarged view is attached after the figure.Figure 2 Widespread α-synuclein expression of the transgene throughout the mice brain

2.5 ICV 注射rAAV2/9 后出現(xiàn)病理性α-突觸核蛋白

在PD 中,第129 位絲氨酸磷酸化(pS129)及聚集形式的α-突觸核蛋白常被檢測到,被認為是PD的標志之一。 在轉(zhuǎn)基因鼠中,我們通過免疫組化檢測表明,pS129 在3 月齡小鼠嗅球及皮層中(圖5A)均出現(xiàn),且在嗅球的神經(jīng)元中強陽性染色。 進一步用抗聚集形式的α-突觸核蛋白單克隆抗體(αsynuclein 5G4)檢測其表達時(圖5B),發(fā)現(xiàn)其在嗅球和皮層亦出現(xiàn)陽性染色,表達模式與pS129 一致。

3 討論

rAAV 的研究及廣泛應(yīng)用,為我們高效地基因傳遞提供了非?？焖儆行У墓ぞ?先前多項研究通過靶向小鼠黑質(zhì)、紋狀體及嗅球構(gòu)建α-突觸核蛋白局部過表達小鼠模型,極大地促進人們對PD 發(fā)病機理的認識,然而由于靶向定點腦區(qū)注射后蛋白質(zhì)過表達的區(qū)域局限性,所以在該研究中,基于rAAV2/9 在神經(jīng)系統(tǒng)中的高效的傳遞效率[21-22],我們通過新生乳鼠側(cè)腦室注射攜帶人源SNCA-EGFP或EGFP的rAAV2/9,構(gòu)建了全腦人源α-突觸核蛋白高表達的轉(zhuǎn)基因鼠。 在注射rAAV2/9 后立即解剖乳鼠腦,發(fā)現(xiàn)固綠染色的病毒液在大腦各腦室之間擴散,表明注射位點的準確性。 前期的研究表明注射的時間點影響注射效率[15],于是在本實驗中嚴格控制注射時間在出生后12 個小時之內(nèi)。

在小鼠成長到2 周或3 個月后,用免疫熒光和Western blot 實驗檢測到了2 周及3 個月齡α-突觸核蛋白在全腦中廣泛的表達(圖1 所示),這表明通過乳鼠側(cè)腦室注射的方式在注射后早期α-突觸核蛋白便能高表達,提示可以用此模型探究α-突觸核蛋白在小鼠出生后腦發(fā)育過程中的作用。 此外,Western blot、免疫熒光及免疫組化實驗表明,α-突觸核蛋白趨向于在小鼠嗅球、皮層、海馬、間腦及中腦中高表達,而在小腦中表達量稍低,這可能與病毒感染的細胞偏好性或者α-突觸核蛋白表達的細胞偏好性有關(guān),其具體的機理仍然需要進一步研究。此外,進一步通過免疫熒光探究α-突觸核蛋白的亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)在嗅球、皮層、海馬及小腦中,α-突觸核蛋白有胞核定位的現(xiàn)象,而之前的研究結(jié)果表明,α-突觸核蛋白核易位與細胞毒性相關(guān)[25-26],提示這幾個腦區(qū)的α-突觸核蛋白可能產(chǎn)生細胞毒性。有趣的是,α-突觸核蛋白在小腦浦肯野細胞中高表達,這提示α-突觸核蛋白可能在小鼠的浦肯野細胞中發(fā)揮特定未知的功能。 免疫熒光結(jié)果表明,α-突觸核蛋白在多巴胺能神經(jīng)元中高表達,這為之后研究α-突觸核蛋白參與PD 發(fā)生的機理奠定基礎(chǔ)。

注:A:α-突觸核蛋白在中腦黑質(zhì)(SN)中表達,TH:多巴胺能神經(jīng)元標志物；B:α-突觸核蛋白在各腦區(qū)的表達及定位。圖3 α-突觸核蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達及亞細胞定位Note. A, α-synuclein is expression in the Substantia Nigra(SN). TH, The marker of dopaminergic neuron. B, Expression and subcellular localization of α-synuclein in different brain regions.Figure 3 Expression and subcellular localization of α-synuclein throughout the whole mice brain

之前的研究認為,星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞參與的神經(jīng)炎癥與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27-28],于是我們檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞的變化,有趣的是,在轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞嚴重增生,這進一步提示α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能參與到PD 的發(fā)生發(fā)展中。 最重要的是,在PD 患者的尸腦組織中,常檢測到α-突觸核蛋白pS129 及聚集的現(xiàn)象[29-31],而在通過rAAV2/9 構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因鼠的嗅球及皮層中均檢測到pS129 及聚集的現(xiàn)象,且在嗅球處高表達,這提示嗅球及皮層與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

總之,我們成功用攜帶人源SNCA的rAAV2/9構(gòu)建了α-突觸核蛋白的全腦轉(zhuǎn)基因鼠,α-突觸核蛋白在整個腦中廣泛表達,并出現(xiàn)了膠質(zhì)增生及病理性α-突觸核蛋白表達的現(xiàn)象。 該轉(zhuǎn)基因模型的成功建立,將為探究α-突觸核蛋白的生理作用及其在PD 中的作用提供一定的基礎(chǔ)。

注:A:過表達α-突觸核蛋白引起黑質(zhì)(SN)的星形膠質(zhì)細胞增生；B:過表達α-突觸核蛋白引起海馬(Hip)的星形膠質(zhì)細胞增生；C:過表達α-突觸核蛋白引起海馬(Hip)的小膠質(zhì)細胞增生；D:過表達α-突觸核蛋白引起皮層(CTX)的小膠質(zhì)細胞增生。GFAP:星形膠質(zhì)細胞標志物；Iba 1:小膠質(zhì)細胞標志物。圖4 α-突觸核蛋白過表達引起膠質(zhì)細胞增生Note. A, Overexpression of α-synuclein incraese astrogliosis in Substantia nigra. B, Overexpression of α-synuclein incraese astrogliosis in Hippocampus. C, Overexpression of α-synuclein incraese microgliosis in Hippocampus. D, Overexpression of α-synuclein incraese microgliosis in Cerebral cortex. GFAP, The marker of astrocyte. Iba 1, The marker of microglia.Figure 4 Overexpression of α-synuclein associated with astrogliosis and microgliosis

注:A:免疫組化檢測嗅球(OB)和皮層(CTX)中α-突觸核蛋白pS129 的表達分布；B:免疫組化染色檢測嗅球(OB)和皮層(CTX)中聚集形式的α-突觸核蛋白的表達分布。圖5 病理性的α-突觸核蛋白的檢測Note. A, pS129 was detected within the neuronal soma in the olfactory bulb(OB)and cerebral cortex(CTX). B, Aggregated α-synuclein was detected within the neuronal soma in the olfactory bulb(OB)and cerebral cortex(CTX).Figure 5 Detection of α-synuclein-associated pathology