劉夢(mèng)迪董 偉張 旭陳 煒高 翔高 珊張連峰呂 丹*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

剪接體在真核細(xì)胞新生RNA 轉(zhuǎn)錄物的加工中起重要作用。 剪接體是小核RNA 和蛋白質(zhì)的復(fù)合物,可從初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pre-mRNA)中去除(剪接)內(nèi)含子和非常規(guī)外顯子,從而將識(shí)別的外顯子組裝(剪接)成成熟的mRNA。 它主要是基因特異性的,并且是由于順式調(diào)控序列中的突變指導(dǎo)了外顯子的剪接識(shí)別[1]。 但是,已知有越來越多的突變靶向剪接體的組分,因此潛在地產(chǎn)生了全局而非基因特異性的RNA 剪接變化。 剪接位點(diǎn)的識(shí)別可以通過跨越內(nèi)含子以及跨越外顯子兩種機(jī)制進(jìn)行,該方式可極大的增加蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達(dá)的復(fù)雜程度[2-3]。

近十年來,已有多篇研究報(bào)道剪接復(fù)合體相關(guān)基因突變與多種臨床疾病相關(guān)[4-5]。 而PRPF40B是已發(fā)現(xiàn)的編碼剪接體化合物的基因之一,該類基因還包括, SF3B1, SRSF2, U2AF1, ZRSR2, SF1,SF3A1 及U2AF2。 前mRNA 加工因子(Pre-mRNA processing factor,PRPF)是研究發(fā)現(xiàn)的一種參與前mRNA 剪接的蛋白質(zhì)。 人PRPF 基因編碼一個(gè)1007個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),包含一個(gè)N-末端340 個(gè)氨基酸的富含Arg/Ser 的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通常存在于前mRNA 剪接因子中。 PRPF 的催化結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和絲裂原活化蛋白激酶具有同源性[6]。

PRPF40B 屬于U2 核糖核蛋白體依賴型剪接復(fù)合體相關(guān)基因,目前,已有研究表明PRPF40B 基因突變, 與骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS),慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)和急性粒細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)有關(guān)[7-10]。 在患有骨髓惡性腫瘤的患者中,已經(jīng)描述了八個(gè)核心剪接體基因中的體細(xì)胞突變-SF3B1, SRSF2, U2AF35( U2AF1 ), ZRSR2, SF3A1, PRPF40B, U2AF65(U2AF2),其中PRPF40B 的突變發(fā)生頻率為1%左右[1,11-12]。 此外,有研究表明PRPF40B 基因突變還與多種實(shí)體腫瘤發(fā)生相關(guān),包括乳腺癌,肝癌,胰腺癌和黑色素瘤等[2,13]。

所以, 為深入研究剪接復(fù)合體相關(guān)基因PRPF40B 的生物學(xué)作用,動(dòng)物模型是重要的工具,本實(shí)驗(yàn)室依托研究所和基因工程技術(shù)平臺(tái),利用CRISPR/Cas9 技術(shù)首次構(gòu)建了PRPF40B 基因敲除大鼠模型,為開展該基因的生物學(xué)功能研究,以及其在多種疾病病理進(jìn)程中所扮演角色的深入研究,提供了體內(nèi)動(dòng)物模型工具。 并且在初步的研究分析中,發(fā)現(xiàn)該基因敲除可誘發(fā)心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)異常改變。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 月齡雄性SPF 級(jí)Prpf40b 基因敲除SD 大鼠及同窩對(duì)照大鼠各6 只,體重550 ～720 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究中心建立及培育,同時(shí)敲除大鼠培育過程中使用的SD 大鼠,均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0011]。 大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2019-0014],同時(shí)動(dòng)物飼養(yǎng)間采用12 h交替明暗照明,動(dòng)物自由飲水?dāng)z食。 同時(shí),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及的動(dòng)物操作程序已得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)(ZLF18003),實(shí)驗(yàn)過程中遵循了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

PCR 引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；4%甲醛溶液購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；DNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest Agarose 公司；凝膠電泳儀購自美國伯樂公司；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)購自德國徠卡公司；PCR 儀購自美國伯樂公司；氣體麻醉機(jī)購自英國斯特普科技有限公司；病理切片掃描機(jī)購自德國徠卡公司；小動(dòng)物成像系統(tǒng)Vevo3100 購自加拿大VisualSonics 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 載體構(gòu)建及基因型鑒定(vector construction and genotyping)

利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的成熟的CRISPR/Cas9技術(shù)操作平臺(tái)[14],構(gòu)建Prpf40b 基因敲除大鼠。 首先研究人員依據(jù)Prpf40b 基因第二外顯子,設(shè)計(jì)sgRNA,并利用MEGAshortscript T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1354,Ambion,美國)。 將Cas9 蛋白(30 ng/μL)和sgRNA(皆10 ng/μL)混合后,經(jīng)顯微注射到受精卵、移植至假孕母子子宮內(nèi),手術(shù)完成后常規(guī)飼養(yǎng)。

對(duì)出生后仔鼠,制備組織基因組,經(jīng)PCR 鑒定其基 因 型, PCR 引 物: 5’ TCCTCGACAGCCACA TACTCAG3’ 及5’ GTCTTCACTTCGACCTGGTTCA G3’。 PCR 條件:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性20 s,60℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35 個(gè)循環(huán)。 野生條帶和敲除條帶分別是1890 bp 和809 bp。

1.3.2 超聲影像分析技術(shù)(echocardiography analysis)

大鼠經(jīng)異氟烷(1.5%～2.5%)麻醉,胸前區(qū)脫毛,仰臥位固定于加熱板上,保持體溫恒定,同時(shí)四肢固定,待呼吸平穩(wěn)后,利用16 兆赫茲探頭(Vevo3100, 加拿大),經(jīng)胸前區(qū)長軸和短軸兩個(gè)切面,采集B-mode 和M-mode 信號(hào),經(jīng)3100 信號(hào)及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),導(dǎo)出超聲參數(shù),包括左室收縮末期內(nèi)徑 ( LVESD, left ventricular ( LV ) end-systole diameter)； 左室 舒張 末 期內(nèi) 徑( LVEDD, left ventricular(LV)end-diastole diameter)；左室收縮末期容積(LVESV, left ventricular (LV) end-systole volume)； 左室舒張末期容積( LVEDV, left ventricular(LV)end-diastole volume)；每搏輸出量(SV, stroke volume)等。

1.3.3 病理組織學(xué)分析(histological analysis)

大鼠經(jīng)安樂死后,摘取心臟,經(jīng)生理鹽水清洗后,固定于4%甲醛中固定48 h。 隨后經(jīng)脫水后的心臟組織經(jīng)智能石蠟包埋機(jī)包埋制備成蠟塊,推拉式切片機(jī)進(jìn)行切片(切片厚度4 μm),恒溫烤箱將切片烤干后,經(jīng)全自動(dòng)染色機(jī)完成HE(hematoxylineosin stain)染色,自動(dòng)封片機(jī)完成封片。 切片掃描(徠卡TCS SP2, 德國) 后經(jīng)Aperio ImageScope v8.2.5 軟件分析并導(dǎo)出病理圖片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)來表示,均數(shù)間采用Student’st-tests 分析,P＜0.05 為有顯著性差異。

注:A:利用CRISPR/Cas9 技術(shù),Prpf40b 基因敲除大鼠構(gòu)建示意圖,site1、site2:靶點(diǎn)設(shè)計(jì)位置。 B:Prpf40b 基因敲除大鼠基因型PCR 鑒定電泳凝膠圖像,P1～P3 分別是敲除純合子,雜合子及同窩野生型對(duì)照孔；1、2、4、5:敲除雜合子大鼠基因型條帶；3:同窩野生型基因型條帶；6:敲除純合子大鼠基因型條帶。圖1 Prpf40b 基因敲除大鼠構(gòu)建及鑒定Note. A, Schematic diagram of Prpf40b knockout rat with CRISPR/Cas9 technology. site1/site2,target design sites.B,Genotyping identification of Prpf40b knockout rat through PCR. P1 ～P3, Sample for reference of homozygosis,heterozygosis and wild-type. 1,2,4 and 5, Heterozygosis band. 3, Wild-type band. 6, Homozygosis band.Figure 1 Establishment and genotyping of Prpf40b knockout rat

2 結(jié)果

2.1 Prpf40b 基因敲除大鼠的建立及繁育

利用CRISPR/Cas9 技術(shù),建立Prpf40b 基因敲除大鼠,經(jīng)測(cè)序及PCR 技術(shù)鑒定,敲除大鼠第5、6、7、8 以及部分第9 外顯子已敲除,構(gòu)建示意圖見圖1A。

將首建鼠與野生型SD 大鼠進(jìn)行雜交,PCR 技術(shù)鑒定仔代鼠基因型,仔代敲除雜合子大鼠間再進(jìn)行第二輪雜交,仔代大鼠即可獲得敲除純合子,PCR鑒定示意圖見圖1B。

觀察至12 月齡時(shí),Prpf40b 基因敲除雜合子和純合子大鼠外觀形態(tài)及體重等,未見明顯異常。 隨后的心臟超聲影像學(xué)及病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn),皆選取Prpf40b 基因敲除純合子大鼠及同窩陰性大鼠進(jìn)行觀察及分析。

2.2 Prpf40b 基因敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能分析

經(jīng)基因型鑒定后,選用2 月齡Prpf40b 基因敲除大鼠和同窩陰性對(duì)照大鼠,進(jìn)行心臟超聲影像分析,結(jié)果顯示,與同窩陰性大鼠相比,敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)及形態(tài)各參數(shù)未見明顯異常(數(shù)據(jù)未列出)。

隨后選用12 月齡敲除大鼠和同窩陰性對(duì)照大鼠,進(jìn)行心臟超聲影像分析,同時(shí)采集B-mode 和Mmode 影像。 通過M-mode 影像觀察,12 月齡敲除大鼠,左室內(nèi)徑明顯減小(圖2)。

隨后通過Veov3100 分析系統(tǒng)分析并導(dǎo)出各超聲參數(shù),結(jié)果顯示,左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD, left ventricular(LV)end-diastole diameter)顯著變小,減少了15.6%(圖3A,P=0.0069)；左室收縮末期內(nèi)徑 ( LVESD, left ventricular ( LV ) end-systole diameter)顯著變小,減少了22.2%(圖3B,P=0.0134)； 左室舒張末期容積( LVEDV, left ventricular(LV)end-diastole volume)顯著降低,降低了31.5%(圖3C,P=0.0068)；左室收縮末期容積(LVESV, left ventricular(LV)end-systole volume)顯著降低,降低了44.1%(圖3D,P=0.0057)；同時(shí),每搏輸出量(SV, stroke volume)和心輸出量(CO,cardiac output)顯著降低,分別降低了26.1%(圖3E,P= 0.0229)和25.9%(圖3F,P= 0.0306)。

圖2 Prpf40b 基因敲除大鼠超聲影像分析M-mode 截圖Figure 2 M-mode screenshot from echographic analysis in Prpf40b knockout rat

2.3 Prpf40b 基因敲除大鼠心肌組織學(xué)觀察

通過超聲影像分析,12 月齡Prpf40b 基因敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)出現(xiàn)異常,隨后我們選取12 月齡敲除大鼠,經(jīng)摘取心臟,常規(guī)固定并制備心肌組織石蠟切片,隨后進(jìn)行HE 染色,切片掃描后經(jīng)Aperio分析心肌組織學(xué)改變。

與同窩陰性對(duì)照大鼠相比,敲除大鼠心臟整體變小,心室腔變小(圖4A),這與敲除大鼠通過超聲影像學(xué)觀察到的結(jié)果一致。 在顯微水平,與同窩陰性對(duì)照大鼠相比,敲除大鼠心肌纖維出現(xiàn)排列不齊,心肌纖維粗細(xì)不均一,同時(shí),心肌纖維間肌漿網(wǎng)明顯擴(kuò)張,以及心肌纖維染色著色不均一等現(xiàn)象(圖4B)。

同時(shí),我們通過統(tǒng)計(jì)12 月齡敲除大鼠心臟濕重與體重比值,即心重體重比(HW/BW, heart weight/body weight),進(jìn)一步確認(rèn)心臟形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),敲除大鼠心重體重比顯著下降,下降了15.6%(圖4C,P=0.0348),與超聲影像學(xué)及病理組織學(xué)觀察結(jié)果一致。

注:A:LVEDD,左室舒張末期內(nèi)徑；B:LVESD,左室收縮末期內(nèi)徑；C:LVEDV,左室舒張末期容積；D:LVESV,左室收縮末期容積；E:SV,每搏輸出量；F:CO,心輸出量。 與野生對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。圖3 Prpf40b 基因敲除大鼠超聲影像參數(shù)分析Note. A, LVEDD, left ventricular(LV)end-diastole diameter. B,LVESD,left ventricular(LV)end-systole diameter. C, LVEDV, left ventricular(LV)end-diastole volume. D, LVESV, left ventricular(LV)end-systole volume. E, SV, stroke volume. F, CO, Cardiac output. Compared with wild type rats, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 3 Echography parameter analysis in Prpf40b knockout rat

注:A:12 月齡Prpf40b 敲除大鼠心臟長軸整體切片HE 染色；B:敲除大鼠心臟長軸整體切片HE 染色高倍截圖；C:敲除大鼠心重體重比。 與野生對(duì)照組比較,*P＜0.05。圖4 Prpf40b 基因敲除大鼠病理組織學(xué)分析Note. A, The whole-heart longitudinal sections with HE staining from Prpf40b knockout rat at 12 months old. B, Magnification of the whole-heart longitudinal sections with HE staining from Prpf40b knockout rat. C, Ratio of heart weight/ body weight.Compared with wild type rats, *P＜0.05.Figure 4 Histological analysis in myocardial of Prpf40b knockout rat

3 討論

酵母剪接因子Prp40 是一種必需的U1-snRNP相關(guān)蛋白,作為支架參與剪接體復(fù)合物形成的早期步驟。 Prp40 的兩種哺乳動(dòng)物同源基因包括PRPF40A,也被稱為HYPA(亨廷頓相互作用蛋白A) 或 FBP11 ( formin-binding protein 11 ) 和PRPF40B,即已知的HYPC(亨廷頓相互作用蛋白C)[15]。

研究表明PRPF40A 和PRPF40B 參與剪接體的早期組裝,但功能尚不清楚。 PRPF40B 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),包括亨廷頓病和Rett 綜合征。 此外, 近幾年骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)中檢測(cè)到參與剪接位點(diǎn)識(shí)別的剪接體成分的突變[16]。 PRPF40B 是剪接體突變檢測(cè)到的靶點(diǎn)之一,在整個(gè)開放閱讀框架中,PRPF40B 的變化以錯(cuò)義突變的形式出現(xiàn),提示這些突變可能導(dǎo)致功能喪失。 PRPF40B 定位于富含剪接因子的核斑點(diǎn),結(jié)合SF1 和U2AF65,并在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種剪接事件。 研究顯示PRPF40B 缺失增加了Fas/CD95 受體數(shù)量和細(xì)胞凋亡,表明PRPF40B 能夠改變關(guān)鍵凋亡基因的選擇性剪接來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。 這些結(jié)果支持了PRPF40B 在導(dǎo)致外顯子選擇性剪接的早期事件中的作用,并可能為PRPF40B 相關(guān)疾病的分子機(jī)制提供重要參考[17]。

以往的研究表明,PRPF 的突變導(dǎo)致細(xì)胞周期中前mRNA 的積累和G1/S 轉(zhuǎn)換受損。 PRPF 對(duì)激酶、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子、紡錘體檢查點(diǎn)蛋白和癌細(xì)胞生長具有不同的作用。 PRPF 被證明是U5 snRNP 相關(guān)激酶,PRPF 與BRG1 和N-CoR 相互作用,這是核激素共激活和共抑制復(fù)合物的兩個(gè)組成部分。 PRPF 與U5-snRNP 和N-CoR 脫乙酰酶復(fù)合物相關(guān),被認(rèn)為可以協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的前mRNA剪接和染色質(zhì)重塑事件[18-20]。 PRPF 可觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),降低HCT116、PC3、B16-F10 黑色素瘤細(xì)胞的侵襲性。PRPF 可通過激活細(xì)胞生存信號(hào)通路、重新排列肌動(dòng)蛋白骨架和誘導(dǎo)EMT 來阻斷白藜蘆醇的凋亡作用。

PRPF40B 可抑制髓系細(xì)胞缺氧,其低表達(dá)可能導(dǎo)致白血病的發(fā)生[21]。 目前已有報(bào)道PRP6、SWAP 和PNN 與PRPF 相互作用,并且PRPF 被證明是U5 snRNP 相關(guān)激酶。 特別是,小核糖核蛋白復(fù)合物的成員PRPF6 被證明能促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖。最近的研究表明,各種選擇性剪接事件模式的改變?cè)诮Y(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[6]。

Prp40 蛋白結(jié)構(gòu)與人類中相對(duì)少量的蛋白(包括PRPF40A,PRPF40B 和hTCERG1)共有,它們均參與剪接和轉(zhuǎn)錄延伸的偶聯(lián)。 最接近的人類直系同源物PRPF40A 的功能與酵母Prp40 類似。PRPF40A 的WW 域?qū)τ谄涠ㄎ坏胶税唿c(diǎn)至關(guān)重要。 PRPF40A 與SF1 和U2AF 相互作用,它存在于剪接體復(fù)合體A 和B 中,但不存在于C 中,這與Prp40 在早期剪接體組裝中的作用一致。 PRPF40A與U2-snRNP 和參與轉(zhuǎn)錄延伸的蛋白質(zhì)可發(fā)生免疫共沉淀。

PRPF40A 和PRPF40B 都通過Pol II CTD 與延伸復(fù)合物相互作用調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)錄剪接,并且都與亨廷頓氏病大腦中擴(kuò)展的亨廷頓多谷氨酰胺束結(jié)合,并參與其他神經(jīng)退行性綜合征。 即使PRPF40B 不具有任何RNA 識(shí)別基序(RRM),它也可能通過橋接5′s 的U1 和與BPS 結(jié)合的SF1 來調(diào)節(jié)AS。 此外,PRPF40B 控制重要凋亡基因(例如Fas)的其他剪接位點(diǎn)的選擇。 PRPF40B KO 上調(diào)了低氧信號(hào),再加上其在AML 中的低表達(dá),提示該SF 在髓樣白血病中的作用。 在 Akt/MAPK 通路中發(fā)現(xiàn)了PRPF40B 調(diào)控的酶的PPI 聚集,這是已知的相互調(diào)節(jié)缺氧的途徑[21]。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)PRPF40B 基因敲除可誘發(fā)模型大鼠心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變,包括整體結(jié)構(gòu)形態(tài)及顯微形態(tài)的改變,其機(jī)制可能與該基因控制重要凋亡基因相關(guān),但具體的誘導(dǎo)機(jī)制,還需要后續(xù)深入的分子機(jī)制研究。 同時(shí)本文建立的PRPF40B基因敲除大鼠為該基因參與多種疾病病理進(jìn)程調(diào)控的作用研究,提供了體內(nèi)工具動(dòng)物,為剪接復(fù)合體相關(guān)基因的功能研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。