曹 旺李 霞劉彩霞鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室,長沙 410208)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)是嚴重危害人類健康的心血管疾病。經(jīng)皮冠狀動脈介入術( percutaneous coronary intervention, PCI)治療可以很好地實現(xiàn)冠脈血運重建,改善患者的生存質(zhì)量,明顯降低患者的死亡率,但術后由于血管內(nèi)膜損傷后引起的血管再狹窄是困擾介入治療的難題,也是影響患者預后和再發(fā)缺血性心臟病的重要原因。 眾所周知,血管再狹窄的基本病理特征是血管內(nèi)膜增生,在PCI 術后,由于血管內(nèi)膜損傷,導致內(nèi)膜下血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)遷移至內(nèi)膜并發(fā)生增殖,使血管內(nèi)膜增厚而致血管再狹窄的發(fā)生[1-3]。 因此,防治PCI 術后血管內(nèi)膜增生引起的血管再狹窄是當前迫切需要解決的問題。 而建立動物血管內(nèi)膜增生模型是其防治研究的前提。 目前,血管內(nèi)膜增生模型的建立方法主要有球囊導管損傷血管內(nèi)膜引起內(nèi)膜增生和高脂喂養(yǎng)引起動脈粥樣硬化血管內(nèi)膜增生等方法[4-6]。 球囊導管可損傷血管內(nèi)皮,引起內(nèi)膜增生,可用于大鼠、家兔等內(nèi)膜增生模型的建立,但手術操作復雜,動物存活率較低,引起病變的程度變異較大,不利于防治方法的評價。 動脈粥樣硬化模型主要用于小鼠和家兔,可在一定程度上引起血管內(nèi)膜增生,但實驗周期長,病變部位難以控制[7-10]。 家兔是動脈粥樣硬化的易感動物,高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)可以形成類似人動脈粥樣硬化的病變,而單純用高脂高膽固醇喂養(yǎng)雖然可誘發(fā)動脈粥樣硬化病變,但血管內(nèi)膜增生病變不典型,實驗周期長。 因此,建立一種病變明確、操作簡單的血管內(nèi)膜增生模型是研究其病理生理和防治的重要前提。 本實驗采用家兔高膽固醇飼料喂養(yǎng)聯(lián)合硅橡膠管頸總動脈套管術使頸總動脈狹窄的方法,建立了一種頸總動脈血管內(nèi)膜增生模型,為血管內(nèi)膜增生病理生理和防治方法的研究提供了有效手段。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭種大白兔雌雄各15 只,10 周齡體重1.8～2.0 kg,均購于湖南太平生物科技有限公司[SCXK(湘)2015-0004]。 實驗在湖南省中醫(yī)藥研究院動物中心進行[SYXK(湘)2015-0008],動物實驗得到湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學動物實驗倫理委員會批準(2019-0027),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

改良Masson 三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號20190613)；二步法免疫組化法檢測試劑盒(北京中杉金橋,批號2015G0115)；DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋,批號K196721D)；小鼠抗α-smooth muscle actin(α-SMA)單克隆抗體(abcam,批號GR3257713-3)；小鼠抗Osteopontin(OPN)單克隆抗體(NOVUS,批號NB110-89062)；兔抗TNFα多克隆抗體(Bioss,批號bs-2150R)；兔抗1 L-1β 多克隆抗體(Bioss,批號bs-0812R)；兔抗Collagen 1(Col-1)多克隆抗體(Bioss,批號bs-0578R)。 石蠟切片機(英國Shado 公司,HM325)；光學顯微鏡(日本Olympus 公司,BA410E)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

實驗前適應性飼養(yǎng)1 周,飼養(yǎng)于普通級動物實驗室,室溫25℃、濕度45%～65%,喂食標準飼料,自由攝食和水。 將家兔隨機分為假手術組(A 組),高脂+單側(cè)套管組(B 組,按造模時間分為B1、B2 亞組),高脂+雙側(cè)套管組(C 組,按造模時間分為C1、C2 亞組),每組6 只,雌雄各3 只排除性別干擾。 按頸總動脈套管法改良制作頸總動脈血管內(nèi)膜增生模型[11]:動物術前12 h 禁食不禁水,耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉后仰臥固定,頸部正中切口,分離兩側(cè)頸總動脈。 高脂+單側(cè)套管組將一個無活性的柔軟的硅橡膠管(長度20 mm,內(nèi)徑1.0 mm)沿長軸剪開后,套在分離的左側(cè)頸總動脈外面,用絲線結(jié)扎固定。 高脂+雙側(cè)套管組將兩個硅橡膠管分別套在分離的左右側(cè)頸總動脈外面,用絲線結(jié)扎固定。 術后第1 天起連續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料(2%膽固醇+3%橄欖油+95%普通飼料)。 假手術組只進行手術操作分離頸總動脈,不進行血管套管,從術后第1 天起連續(xù)喂養(yǎng)普通飼料。 術中A組、B1 組、C1 組麻醉意外死亡1 只,各組術后肌注青霉素7 d 抗感染,術后未有動物死亡。 分別于術后2 周、3 周處死動物檢測,取材時硅橡膠管脫落者即為造模不成功,其中B2 組1 只,C1 組1 只,C2 組2 只。

1.3.2 檢測指標

血管內(nèi)膜增生形態(tài)學計量分析:取損傷段頸總動脈,在PBS 緩沖液中將血管剝離干凈,放入4%多聚甲醛固定7 d,乙醇梯度脫水,石蠟垂直定向包埋,每段血管間斷均勻切取8 片后按試劑盒說明行Masson 染色,以病理圖像分析系統(tǒng)測定中膜面積(media area,MA),內(nèi)膜面積(intimal area,IA)、內(nèi)膜中線周長、中膜中線周長,計算中膜厚度(media thickness,MT)、內(nèi)膜厚度(intimal thickness,IT)、內(nèi)膜面積增生比率(hyperplasia ratio of intimal area,HRIA)、內(nèi)膜厚度增生比率(hyperplasia ratio of intimal thickness,HRIT),以評價血管內(nèi)膜增生程度。計算公式如下:

免疫組化法測定損傷段頸總動脈增生內(nèi)膜中α-SMA、OPN、TNF-α、1L-1β、Col-1 蛋白表達:按照免疫組化試劑盒說明書操作:將損傷段血管組織置4%多聚甲醛固定7 d,乙醇梯度脫水,石蠟垂直定向包埋,石蠟切片機均勻切片,每厚約4 μm；60℃烤片過夜；脫蠟水化；微波抗原修復；冷卻至室溫后每張切片滴加一抗50 μL(小鼠抗α-SMA 單克隆抗體,稀釋濃度1 ∶2000,小鼠抗OPN 單克隆抗體,稀釋濃度1 ∶200,兔抗TNF-α 多克隆抗體,稀釋濃度1 ∶200,兔抗1L-1β 多克隆抗體,稀釋濃度1 ∶200,兔抗Col-Ⅰ多克隆抗體,稀釋濃度1 ∶200),4℃孵育過夜；然后按PV-9000 二步法檢測試劑盒滴加二抗,37℃溫育30 min；DAB 顯色,蘇木素復染,脫水與透明后封片。 光鏡下可見陽性表達呈棕黃色點狀或纖維狀染色,每張切片選擇5 個不同視野進行拍照,用Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件測量陽性染色積分光密度(integrated optical density,IOD)值以及陽性染色面積,并計算出平均IOD 值以反映目的蛋白的表達強度。 平均積分光密度值=IOD Sum/Area Sum(μm2)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)膜病理形態(tài)學改變

Masson 染色顯示,假手術組血管內(nèi)膜內(nèi)彈力膜完整,呈單層,未見明顯增生。 各實驗組血管內(nèi)膜呈均一或不均一增生,大量VSMC 增生,細胞排列紊亂,內(nèi)膜增生明顯,向血管管腔呈向心性或偏心性增厚。 其中單側(cè)套管組術后2 周和3 周內(nèi)膜均呈局限性增生,術后3 周的增生程度大于2 周。 雙側(cè)套管組內(nèi)膜多呈向心性增厚,術后2 周增生程度較輕,術后3 周見明顯的內(nèi)膜增生,血管管腔狹窄明顯(圖1)。

2.2 各組增生內(nèi)膜形態(tài)計量學指標的比較

假手術組血管內(nèi)膜無明顯增生。 與假手術組比較,單側(cè)套管2 周組HRIA、HRIT 顯著增加(P＜0.05),單側(cè)套管3 周組IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著增加(P＜0.05)；單側(cè)套管3 周組與2 周組比較,IA、IT、HRIA、HRIT 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 雙側(cè)套管2 周組、3 周組IA、IT、HRIA、HRIT 均較假手術組顯著升高(P＜0.01)；雙側(cè)套管3 周組與2 周組比較,IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著升高(P＜0.05-0.01)。 雙側(cè)套管2 周組與單側(cè)套管2 周組比較,IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著升高(P＜0.05),雙側(cè)套管3 周組與單側(cè)套管3 周組比IA、IT、HRIA、HRIT均顯著增加(P＜0.01)。 (表1)

2.3 各組增生血管內(nèi)膜中α-SMA、OPN、TNFα、1L-1β、Col-1 表達的比較

與假手術組比較,單側(cè)套管2 周組、3 周組和雙側(cè)套管2 周組增生內(nèi)膜中血管平滑肌細胞收縮表型標志蛋白α-SMA 表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),雙側(cè)套管3 周組增生血管內(nèi)膜中α-SMA 表達顯著降低(P＜0.05)。 (圖2)與假手術組比較,單側(cè)套管2 周組、3 周組和雙側(cè)套管2 周組、3 周組增生內(nèi)膜中血管平滑肌細胞合成表型(去分化型)標志物蛋白OPN、細胞外基質(zhì)成分Col-Ⅰ、炎性反應因子IL-1β、TNF-α 表達顯著增高(P＜0.05)。 (圖3、圖4、圖5、圖6)

注:A:假手術組；B1:單側(cè)套管2 周；B2:單側(cè)套管3 周；C1:雙側(cè)套管2 周；C2:雙側(cè)套管3 周。圖1 頸總動脈Masson 染色Note. A, Sham operation group. B1, Unilateral cannula for 2 weeks. B2, Unilateral cannula for 3 weeks. C1, Bilateral cannula for 2 weeks. C2, Bilateral cannula for 3 weeks.Figure 1 Masson staining of common carotid artery

表1 各組血管形態(tài)學計量指標的比較(±s )Table 1 Comparison of blood vessel morphology measurement indexes in each group

表1 各組血管形態(tài)學計量指標的比較(±s )Table 1 Comparison of blood vessel morphology measurement indexes in each group

注:A:假手術組；B1:單側(cè)套管2 周；B2:單側(cè)套管3 周；C1:雙側(cè)套管2 周；C2:雙側(cè)套管3 周。 與假手術組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與2 周比較,▼P＜0.05,▼▼P＜0.01；與同時間單側(cè)比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。Note. A, Sham operation group. B1,Unilateral cannula for 2 weeks. B2,Unilateral cannula for 3 weeks. C1,Bilateral cannula for 2 weeks. C2,Bilateral cannula for 3 weeks.Compared with sham operation group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. Compared with 2 weeks, ▼P ＜ 0.05, ▼▼P ＜ 0.01. Compared with the same time, △P ＜0.05, △△P＜0.01.

組別Groups樣本數(shù)Number of samples MT(μm)MT(μm)IA(μm2)IT(μm)HRIA(%)HRIT(%)A 5 126188.50±8359.12 53.37±3.87 17330.00±1302.05 8.83±0.60 12.15±0.91 14.26±0.74 B1 5 98511.40±8249.99 46.56±4.12 28397.20±8183.88 15.49±3.89 22.00±5.40* 24.74±5.37*B2 5 132937.40±9779.20 49.92±2.34 39637.40±5450.12* 16.96±0.52* 22.71±1.47* 25.51±1.43*C1 4 106725.40±11931.04 42.04±2.51 62069.60±8655.39**△△ 27.98±2.95**△△ 36.57±3.13**△△ 39.73±3.19**△△C2 4 108896.00±7438.70 42.78±1.79 100494.00±5161.38**▼▼△△ 44.86±2.25**▼▼△△ 48.08±1.67**▼△△ 51.14±1.67**▼△△

3 討論

目前采用套管制作血管狹窄模型有兩種方法,一種是在血管外包裏硅橡膠圈,血管套管可使頸總動脈狹窄,造成局部血流動力學變化,同時動脈套管的機械刺激可誘導血管局部特別是血管外膜的炎癥反應,從而促進動脈內(nèi)膜增生[12]。 但單純的血管套管法造成血管狹窄的時間較長,且病變不穩(wěn)定。 另一種方法是在血管套管的基礎上加高脂飼養(yǎng)[13-14]。 家兔屬于動脈粥樣硬化易感動物,與嚙齒類動物相比,由于嚙齒類動物缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)移酶,僅給予高脂飼料無法引起明顯的動脈粥樣硬化斑塊,因此,嚙齒類動物不容易發(fā)生動脈粥樣硬化性病變,而兔體內(nèi)存在膽固醇酯轉(zhuǎn)移酶,給予高脂飼料可引起脂質(zhì)在內(nèi)膜沉積,因此高脂飼料可誘發(fā)家兔動脈粥樣硬化[15]。 但單純高脂飲食飼養(yǎng)往往實驗周期較長,且病變部位難以控制,故可在高脂基礎上施以損傷血管及其他干預手段,誘導內(nèi)膜出現(xiàn)動脈粥樣硬化性改變而出現(xiàn)血管內(nèi)膜增生。 因此,本實驗采用血管套管法加高脂飼料喂養(yǎng),目的是促進動脈粥樣硬化和血管狹窄,使病變固定在某個部位,便于對血管狹窄病理生理機制和防治方法的研究。 實驗證明,無論是單側(cè)還是雙側(cè)頸總動脈套管加高脂喂養(yǎng),均可誘導血管內(nèi)膜增生,且隨著時間的延長,病變逐漸加重,并且雙側(cè)血管套管誘導的病變較單側(cè)套管法更重。 說明采用硅橡膠圈血管套管加高脂喂養(yǎng)法能誘導明顯的血管狹窄,可縮短血管狹窄形成時間,并使血管狹窄局限發(fā)生在頸總動脈,從而為特定目的的研究提供合適的動物模型。 這種方法引起的血管狹窄與人類動脈粥樣硬化引起的血管狹窄近似,由于套管和高脂刺激,使血管內(nèi)皮細胞損傷,產(chǎn)生血管炎癥反應,誘導血管平滑肌細胞遷移、增殖,導致內(nèi)膜增生而產(chǎn)生血管狹窄。 該方法保存了血管內(nèi)膜的完整性,對血管的損傷小,具有成模時間短、病變固定等優(yōu)點。

注:A:假手術組；B1:單側(cè)套管2 周；B2:單側(cè)套管3 周；C1:雙側(cè)套管2 周；C2:雙側(cè)套管3 周。 與假手術組比較:*P ＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。下圖同。圖2 α-SMA 免疫組化染色Note. A, Sham operation group. B1, Unilateral cannula for 2 weeks. B2, Unilateral cannula for 3 weeks. C1, Bilateral cannula for 2 weeks. C2,Bilateral cannula for 3 weeks. Compared with sham operation group, *P＜0.05, **P＜0.01,***P＜0.001. The same as below.Figure 2 Immunohistochemical staining of α-SMA

圖3 OPN 免疫組化染色Figure 3 Immunohistochemical staining of OPN

圖4 TNF-α 免疫組化染色Figure 4 Immunohistochemical staining of TNF-α

圖5 1L-1β 免疫組化染色Figure 5 Immunohistochemical staining of 1L-1β

圖6 Col-1 免疫組化染色Figure 6 Immunohistochemical staining of Col-1

血管內(nèi)膜增生發(fā)生機制十分復雜,目前認為與內(nèi)皮功能障礙與損傷、血小板聚集與血栓形成、血管平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移、增殖、炎癥反應及合成大量細胞外基質(zhì)等多種因素有關[16-17]。 正常情況下,血管壁自內(nèi)向外依次分為內(nèi)膜、中膜、外膜。 內(nèi)膜主要由內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮下成分組成；中膜主要由血管平滑肌細胞與膠原纖維構(gòu)成；外膜由疏松結(jié)締組織組成,細胞成分以外膜成纖維細胞為主。 本研究表明,在血管套管后不同時間,出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜增生,新生內(nèi)膜中血管平滑肌細胞數(shù)量明顯增多,排列紊亂,增生內(nèi)膜中細胞外基質(zhì)沉積明顯增多,局部增生的內(nèi)膜中炎性反應顯著增強,表明在炎性反應下中膜VSMC 向內(nèi)膜遷移、增生并合成大量細胞外基質(zhì)誘導了血管內(nèi)膜增生。

VSMC 增殖是血管內(nèi)膜增生的中心環(huán)節(jié)。VSMC 增生的前提是其發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化。 在成熟的血管中,VSMC 呈現(xiàn)“收縮”或分化的表型,其特征是可見到VSMC 特異性收縮標志物如α-SMA、平滑肌22α(smooth muscle22α,SM22α)的表達,它們在收縮調(diào)節(jié)中起重要作用[18-19]。 當血管損傷后,VSMC去分化并重新進入細胞周期,發(fā)生細胞增殖,表達OPN 等特異性合成表型(去分化型)標志物。 這種去分化表型在動脈粥樣硬化、PCI 術后再狹窄以及高血壓血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中具有重要的病理生理意義[20]。 有研究發(fā)現(xiàn),在大鼠血管損傷模型,增生內(nèi)膜中α-SMA 表達下調(diào),表明血管受損后VSMC發(fā)生了由分化型向去分化型的表型轉(zhuǎn)化。 血管損傷后局部炎性反應可以誘發(fā)全身的慢性炎性反應,進而促進VSMC 遷移與增殖引起內(nèi)膜增生。 血管中膜的VSMC 增殖并遷移至內(nèi)膜后合成大量細胞外基質(zhì)并在血管壁沉積,從而進一步促進內(nèi)膜的增生。我們的研究也發(fā)現(xiàn),在雙側(cè)套管3 周,增生血管內(nèi)膜中VSMC 收縮型標志物α-SMA 表達顯著降低,合成表型標志物OPN 表達顯著增高,細胞外基質(zhì)成分Col-Ⅰ表達顯著增高,炎性反應因子IL-1β、TNF-α表達顯著增高,提示在這種模型的血管內(nèi)膜增生中,VSMC 由收縮表型轉(zhuǎn)化成合成表型,使VSMC 自血管中膜向內(nèi)膜遷徙,發(fā)生過度增殖,并合成和分泌多種生物活性物質(zhì)和細胞外基質(zhì),導致血管內(nèi)膜增生。

此外,我們在實驗中還發(fā)現(xiàn),在血管套管后,如果硅橡膠管套管與血管貼合不緊密,可能導致套管脫落,導致造模失敗。 因此,在血管套管時,可以采用多重絲線結(jié)扎的方法,使血管套管能緊密地貼合血管,這樣可保證血管狹的形成并且可以保證模型的一致性。

總之,本文采用頸總動脈血管套管加高脂喂養(yǎng)的方法,可以造成明顯的頸總動脈局部血管內(nèi)膜增生,使血管腔狹窄。 而且,在使用這種方法時,雙側(cè)頸總動脈套管比單側(cè)的成模效果好,套管后3 周血管狹窄的程度更明顯。 因此,在應用這種方法造模時,建議采用雙側(cè)血管套管加高脂喂養(yǎng),造模時間以3 周以上為宜。