左旺盛張 鈺張 玲秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

糖尿病作為一種慢性疾病可以引起多器官的損傷,主要是影響腎、視網(wǎng)膜以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)[1]。如果對(duì)糖尿病不進(jìn)行干預(yù),長久以往可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷,出現(xiàn)認(rèn)知功能損害,臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶功能下降,最終導(dǎo)致癡呆。 有研究顯示糖尿病的認(rèn)知障礙原因是由于腦海馬區(qū)的線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致腦部能量供應(yīng)障礙[2],也有研究顯示是由于突觸相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)障礙,導(dǎo)致認(rèn)知問題的出現(xiàn)[3]。 目前對(duì)于糖尿病認(rèn)知障礙沒有理想的治療方法。 丁苯酞(N-butylphthalide,NBP)具有多靶點(diǎn)的保護(hù)作用,如線粒體保護(hù)作用、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等,目前是神經(jīng)內(nèi)科的一線用藥,主要用于中風(fēng)腦梗的臨床治療[4]。 突觸素(synaptophysin,SYN)是一種特異性鈣結(jié)合蛋白,通過調(diào)節(jié)突觸的分化和生長影響突觸結(jié)構(gòu),是影響突觸功能的重要指標(biāo)[5]。 突觸后致密物95(postsynaptic density 95,PSD-95)是突觸后膜致密區(qū)上一種支架蛋白,能激發(fā)突觸的活性,參與突觸的連接和維持,增強(qiáng)突觸重塑[6]；研究顯示,抑制小鼠PSD-95 的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)障礙,突觸缺失[7]。 線粒體是人體能量的生產(chǎn)工廠,海馬線粒體結(jié)構(gòu)的大量損壞會(huì)影響大腦的能量供應(yīng),對(duì)認(rèn)知功能有著一定的影響,認(rèn)知障礙的小鼠線粒體內(nèi)容物以及嵴結(jié)構(gòu)不清,線粒體形態(tài)改變以及裂變?cè)龆郲8]。 本研究采用db/db 小鼠作為糖尿病模型,旨在探討NBP 對(duì)糖尿病小鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu),SYN、PSD-95 表達(dá)量以及認(rèn)知功能的影響。我們?cè)?3 周齡時(shí)檢測(cè)到糖尿病小鼠認(rèn)知障礙,從上述各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示,NBP 通過緩解了海馬突觸相關(guān)蛋白SYN、PSD-95 的表達(dá)下降和改善線粒體結(jié)構(gòu)從而達(dá)到治療db/db 小鼠的認(rèn)知功能障礙的效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

db/db 小鼠(C57BL/KsJ)是Leptin 受體點(diǎn)突變的II 型糖尿病小鼠,出生后6 周即可出現(xiàn)明顯的肥胖和高血糖等糖尿病癥狀,8 ～12 周時(shí)最明顯,并可出現(xiàn)糖尿病腎病等并發(fā)癥。 本研究采用了20 只5周齡SPF 級(jí)雄性糖尿病模型db/db 小鼠體重40 ～43 g,以及5 只同窩出生db/m 雄性小鼠23 ～25 g,均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[SCXK(蘇)2018-0008],飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房[SYXK(京)2019-0014]。 飼養(yǎng)期間自由飲水飲食,溫度(24±1)℃,(12/12)h(光照/黑暗)常規(guī)飼養(yǎng)。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(IACUC-QC19024)遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

NBP 注射液濃度5 mg/mL(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)；兔單克隆抗體SYN、兔多克隆抗體PSD-95、β-actin(美國abcam 公司,貨號(hào)分別為ab32127、ab18258、ab21058)；二抗羊抗兔(中國中杉金橋公司,ZB-2301)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理

將20 只db/db 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組,低、中、高劑量NBP 治療組,以上每組數(shù)量均為5 只。 適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,NBP 注射液按照20、40、60 mg/(kg·d)分別注射給低、中、高劑量治療組；同窩對(duì)照組5 只(正常組)和模型組給予同等體積的生理鹽水腹腔注射,以上各組處理均為6 周。每周進(jìn)行一次體重測(cè)量以及空腹尾靜脈血糖測(cè)量。

1.3.2 小鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力檢測(cè)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試期:將小鼠分別從三個(gè)象限頭朝池壁放入水迷宮,自由游行,計(jì)時(shí)60 s,期間找到平臺(tái)時(shí)追蹤器自動(dòng)停止計(jì)時(shí),記錄時(shí)間為逃逸潛伏期,超過60 s 的記錄為60 s,將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)停留15 s；每個(gè)象限實(shí)驗(yàn)間隔20 min 后再進(jìn)行下一個(gè)象限,共訓(xùn)練5 d；探索期:第6 天撤除平臺(tái),將四小鼠從第二象限放入池中,記錄60 s 小鼠穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)[9]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)取材

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖取材,每組選取3 只小鼠迅速剪下頭顱,迅速取出海馬置于凍存管于液氮中,置于-80℃冰箱中凍存。 兩只小鼠用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)灌注,多聚甲醛灌注后取出海馬置于4%多聚甲醛,用于電鏡觀察。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)小鼠海馬組織SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)量

取出凍存海馬稱量,提取總蛋白；BCA 試劑盒測(cè)量蛋白濃度,配平后在沸水中煮5 min；取20 μg的蛋白進(jìn)行凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；配5%的奶粉封閉1 h 后,分別加SYN、PSD-95,β-tubulin 一抗4℃過夜；羊抗兔二抗孵育1 h；加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像,檢測(cè)條帶灰度值并分析。

1.3.5 透射電鏡觀察海馬區(qū)線粒體結(jié)構(gòu)變化

將剝離出的海馬組織置于4%多聚甲醛,其后標(biāo)本采用不同濃度梯度乙醇進(jìn)行脫水處理,經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋后修塊,采用檸檬酸鉛染色制片后于透射電鏡下觀察[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較行雙因素方差分析,兩兩比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注:與正常組相比,**P＜0.01；與模型組相比,各治療組,P＞0.05。圖1 各組小鼠體重(a)、血糖(b)比較( ±s)Note. Compared to the normal group, **P＜0.01. Compared with model group, each treatment group, P＞0.05.Figure 1 Comparison of body weight (a) and blood glucose (b) in each group

2 結(jié)果

2.1 NBP 對(duì)db/db 小鼠體重和血糖變化無顯著差異

各組與正常組相比,模型組和各個(gè)治療組小鼠血糖及體重明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；模型組與各個(gè)治療組以及組間體重跟血糖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (圖1)

2.2 NBP 改善了db/db 小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的障礙

模型組與正常組相比,水迷宮逃逸潛伏時(shí)間顯著增加,穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少,P＜0.01,說明13周齡時(shí)db/db 小鼠相對(duì)于正常組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重認(rèn)知障礙,糖尿病認(rèn)知障礙模型造模成功；各劑量NBP 治療組與模型組相比,低劑量治療組逃逸潛伏時(shí)間下降,穿越平臺(tái)的次數(shù)提高,P＜0.05；中劑量治療組小鼠逃逸潛伏期相對(duì)與模型組有改善,P＜0.05,且改善效果比低劑量要好；高劑量治療組相對(duì)于模型組小鼠逃逸潛伏期下降,P＜0.05,且效果優(yōu)于低劑量和中劑量治療組。 (圖2)

2.3 NBP 緩解了db/db 小鼠海馬組織中SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)量的下降

模型組與正常組相比,海馬中SYN 與PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)含量顯著降低(P＜0.01)；各治療組與模型組相比,海馬中SYN 與PSD-95 蛋白相對(duì)表達(dá)含量均有所提高(P＜0.05),且高劑量NBP 治療組效果較低劑量組、中劑量組好。 (圖3)

2.4 NBP 降低了db/db 小鼠海馬區(qū)線粒體結(jié)構(gòu)的損傷

正常組的線粒體結(jié)構(gòu)正常,多呈橢圓形,嵴結(jié)構(gòu)清晰并且排列緊密,膜結(jié)構(gòu)完整；模型組線粒體受損,嵴結(jié)構(gòu)稀疏,融合,膜結(jié)構(gòu)損壞,逐漸空泡化,且體積在同樣倍數(shù)下顯著增大；各劑量治療組海馬線粒體大部分結(jié)構(gòu)完整,嵴結(jié)構(gòu)有少量破壞,但相對(duì)與模型組要正常,膜結(jié)構(gòu)也相對(duì)組完整。 (圖4)

注:a:逃逸潛伏期。 與模型組相比,低劑量組*P ＜0.05,**P ＜0.01；中劑量組,#P ＜0.05,##P ＜0.01；高劑量組,$$P＜0.01, $$$P＜0.001。 b:穿臺(tái)次數(shù)。 與正常組相比,**P＜0.01；與模型組相比,##P＜0.01。圖2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶成績比較( ±s)Note. a, Escape lantency. Compared with Model group, Low group *P ＜0.05, **P ＜0.01. Medium group, #P ＜0.05,##P＜0.01. High group, $$P ＜0.01, $$$P ＜0.001. b, The number of crossing-platform. Compared with normal group,**P＜0.01. Compared with the model group, ##P＜0.01.Figure 2 Results of learning and memory in water maze experiment were compared among all groups

注:與正常組相比,**P＜0.01；與模型組相比,各治療組,#P＜0.05。圖3 各組小鼠海馬PSD-95、SYN 表達(dá)量比較(±s)Note. Compared with normal group **P＜0.01. Compared with model group, each treatment group, #P＜0.05.Figure 3 Comparison of the expressions of PSD-95 and SYN in the hippocampus of mice in each group

3 討論

2017 年我國糖尿病患者已達(dá)到1.14 億,成為全球患病人數(shù)最多的國家[11]。 糖尿病并發(fā)癥影響腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)和心血管系統(tǒng),是糖尿病發(fā)病和死亡的主要原因[12]。 然而糖尿病發(fā)展到后期,患者不只是會(huì)出現(xiàn)以上并發(fā)癥,也會(huì)產(chǎn)生認(rèn)知功能的損傷,主要表現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶能力的下降[13]。 目前臨床治療糖尿病措施主要是胰島素注射和口服降糖藥,不能解決糖尿病患者后期出現(xiàn)的認(rèn)知功能損傷。NBP 是我國已批準(zhǔn)用于治療缺血性腦卒中的合成化合物,主要從芹菜籽中提取。 它具有多種生物學(xué)作用,最主要是臨床上用于改善腦梗死的預(yù)后[14],有研究表明NBP 能抑制神經(jīng)元凋亡,具有神經(jīng)保護(hù)作用[15],具有抗氧化和減輕線粒體功能障礙的神經(jīng)保護(hù)作用[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)db/db 小鼠在第13 周檢測(cè)時(shí)認(rèn)知功能已經(jīng)嚴(yán)重受損,表現(xiàn)為db/db 小鼠與對(duì)照組相比,水迷宮潛伏明顯延長,測(cè)試期穿越平臺(tái)次數(shù)顯著下降。

注:紅色箭頭表示線粒體結(jié)構(gòu)。圖4 各組小鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu)電鏡圖Note. The red arrows indicate the mitochondrial structure.Figure 4 Electron micrograph of mitochondrial structure in hippocampus of mice of each group

SYN、PSD-95 能影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能,是研究突觸的重要指標(biāo)[17],PSD-95 作為重要的骨架蛋白,是突觸敏感的結(jié)構(gòu)指標(biāo)[18],PSD-95 的表達(dá)減少說明突出后致密物質(zhì)變薄,突觸活性降低,最終導(dǎo)致突觸傳導(dǎo)發(fā)生障礙[19]。 SYN 是突觸小泡上的膜蛋白,與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,突觸形成及突觸小泡上離子通道密切相關(guān),是突觸功能的標(biāo)志蛋白[20]。SYN 可以通過調(diào)節(jié)軸突和樹突的分化和生長,影響突觸結(jié)構(gòu)[13],SYN 常用來檢測(cè)突觸的密度和分布,其數(shù)量減少表明突觸數(shù)量減少,囊泡減少,從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,影響信號(hào)傳導(dǎo)[21]。 突觸承擔(dān)了傳遞信號(hào)的重要作用,認(rèn)知障礙可能是由突觸功能障礙引起的,神經(jīng)退行性變的認(rèn)知障礙會(huì)發(fā)生明顯的廣泛突觸丟失[22],SYN、PSD-95 能顯著影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能,故本研究檢測(cè)SYN、PSD-95 的表達(dá)情況來觀察糖尿病認(rèn)知障礙是否與突觸相關(guān)蛋白有聯(lián)系。 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組SYN、PSD-95 的表達(dá)量相對(duì)于正常組嚴(yán)重降低,而NBP 治療組相對(duì)于模型組蛋白表達(dá)量的下降有所改善。

線粒體是體內(nèi)最重要的能源中心,90%的三磷酸腺苷(ATP)由線粒體提供[23]。 線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變,是細(xì)胞程序化死亡的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。 糖尿病小鼠體內(nèi)由于長期的高血糖而產(chǎn)生氧化損傷,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的氧化損傷,膜結(jié)構(gòu)破壞,線粒體DNA 破壞,進(jìn)而造成線粒體功能異常,ATP 含量降低[24]。 有研究表明線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS 增多可將自身作為首要靶目標(biāo)導(dǎo)致線粒體損傷,包括對(duì)呼吸鏈及內(nèi)外膜及基質(zhì)蛋白的影響,導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生更多,ATP 合成減少,進(jìn)而線粒體膜通透性改變啟動(dòng)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[25]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NBP 能顯著提高Na+/K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性,保證正常的線粒體膜電位,從而維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[26],NBP 通過增強(qiáng)線粒體膜電位和增加線粒體呼吸鏈復(fù)合體I-IV 和ATPase 的活性來減輕線粒體功能障礙,NBP 改變了調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂的蛋白質(zhì)平衡[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組以及給藥組db/db 小鼠的體重和血糖一直保持很高的水平,符合糖尿病的指標(biāo)。 三個(gè)劑量的NBP 治療組對(duì)于db/db 小鼠的血糖和體重?zé)o改善作用,原因可能是由于NBP 不參與小鼠體內(nèi)的糖代謝和脂代謝的過程。 NBP 對(duì)于海馬線粒體結(jié)構(gòu)損傷有著很大的改善,對(duì)于海馬SYN、PSD-95 的表達(dá)降低有提高作用,NBP 可能通過改善線粒體結(jié)構(gòu)損傷,從而改善腦部的能量供應(yīng),減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡方面起作用,改善海馬突觸的神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及傳導(dǎo)功能等方面改善db/db小鼠的認(rèn)知障礙,且不同劑量的NBP 對(duì)db/db 小鼠的認(rèn)知改善效果不同,本研究區(qū)間內(nèi)高劑量治療組的改善效果優(yōu)于低劑量跟中劑量組。

綜上所述,我們的結(jié)果提示丁苯酞可能通過提高糖尿病小鼠海馬內(nèi)SYN、PSD-95 的表達(dá),改善海馬突觸的功能以及線粒體功能,從而改善了db/db小鼠的認(rèn)知功能障礙。 因此,本研究為丁苯酞改善糖尿病相關(guān)的認(rèn)知功能損害提供了參考,可作為潛在治療策略。