楊 波王孟孟孫 林李 潔喬延恒楊洪濤*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科,天津 300381； 2.安徽省阜陽市第四人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽 阜陽 236021)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)作為主要的腎替代治療方法之一,極大的提高了終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)患者的生存質(zhì)量。但是由于患者長(zhǎng)期使用生物不相容性的腹膜透析液,腹膜的超濾功能逐漸減退,終致超濾衰竭,將迫使患者退出腹膜透析治療[1]。 研究表明,腹膜血管新生是導(dǎo)致超濾衰竭的主要原因之一[2]。 因此,采取有效策略抑制腹膜血管新生,維持腹膜有效超濾是保證PD 患者長(zhǎng)期存活的關(guān)鍵。 中藥復(fù)方因其多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn),在抑制腹膜血管新生方面面具有較好前景[3], 扶腎方(院內(nèi)制劑: 津藥制字Z20130941)由生黃芪、當(dāng)歸、陳皮、半夏、丹參、鬼箭羽、熟軍、仙靈脾組方,具有健脾益腎、通腑降濁的功效。 本研究利用5/6 腎切除尿毒癥大鼠PD 模型,模擬人體內(nèi)PD 過程,觀察扶腎方對(duì)尿毒癥大鼠腹膜形態(tài)、腹膜功能及腹膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-12(interleukin-12,IL-12-)及干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的影響,為扶腎方防治PD 超濾衰竭提供新的思路與方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)SD 大鼠50 只,鼠齡6 ～8 周,體重200～250 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房?jī)?nèi)[SYXK(津)2018-0002]。 本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(TCMLAEC2019067),在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中依照“3R”原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

1.5%及4.25%雙聯(lián)腹膜透析液,廣州百特醫(yī)療用品有限公司；扶腎方飲片購(gòu)于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；塞來昔布(批號(hào):J20140072),美國(guó)輝瑞制藥有限公司；尿素氮(BUN)(C013-2)和肌酐(Cr)(C011-2)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HE 染色試劑盒(G1120)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物醫(yī)藥有限公司；液相芯片試劑盒(RECYTMAG-56K)購(gòu)自美國(guó)MILLIPORE 公司。 Luminex 200 液相芯片分析儀(美國(guó)Luminex 公司)；紫外可見分光光度計(jì)(T6 新世紀(jì)),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；-80℃超低溫冰箱(BCD-215KS),青島海爾股份有限公司；7100 型日立全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

50 只SD 大鼠常規(guī)飼養(yǎng),適應(yīng)環(huán)境1 周后,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、扶腎方低劑量組(FSF-L)、扶腎方高劑量組(FSF-H)、塞來昔布組(Cel),每組10 只。

1.3.2 扶腎方制備

扶腎方組成:陳皮10 g、半夏15 g、黃芪15 g、當(dāng)歸10 g、仙靈脾15 g、丹參30 g、熟軍10 g、鬼箭羽30g。 扶腎方以中藥飲片為原料,經(jīng)過提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成。 按照藥物人和大鼠體表面積計(jì)算方法,折算系數(shù)為0.018。 扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g,按照折算系數(shù)計(jì)算出大鼠等效劑量為0.324 g,每日2 次。

1.3.3 動(dòng)物造模與給藥

正常對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何處理,其余各組大鼠行5/6 腎切除術(shù),術(shù)后1 周檢測(cè)腎功能。 各組腎功能達(dá)標(biāo)后,腹腔注射1.5%腹膜透析液,按每日100 mL/kg,以大鼠右下腹靠近腹股溝中點(diǎn)為穿刺注射部位,各組所注射液體均腹腔內(nèi)保留,不抽出。模型組在規(guī)律腹腔注射腹膜透析液同時(shí)每日生理鹽水2 mL 灌胃,連續(xù)4 周；扶腎方低劑量組在規(guī)律腹腔注射腹膜透析液同時(shí)每日扶腎方324 mg/mL,2 mL/d 灌胃,連續(xù)4 周；扶腎方高劑量組在規(guī)律腹腔注射腹膜透析液同時(shí)每日扶腎方648 mg/mL,2 mL/d 灌胃,連續(xù)4 周；塞來昔布組在規(guī)律腹腔注射腹膜透析液同時(shí)每日塞來昔布溶液1.8 mg/mL,每天灌胃2 mL,連續(xù)4 周；正常對(duì)照組予每日生理鹽水2 mL 灌胃,連續(xù)4 周。

1.3.4 大鼠血清肌酐和尿素氮水平的檢測(cè)

在右腎切除術(shù)后第4 周從大鼠眶后靜脈叢取血,低溫高速離心機(jī)3500 r/min 離心10 min,留取上清液,應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清肌酐和尿素氮的水平。

1.3.5 各組大鼠腹膜組織HE 染色

取大鼠壁層腹膜組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察大鼠腹膜形態(tài)學(xué)變化。

1.3.6 各組大鼠腹膜功能檢測(cè)

行腹膜平衡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)大鼠腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,方法:各組大鼠殺檢前,每只大鼠腹腔注射4.25%腹膜透析液25 mL,4 h 后麻醉大鼠,抽取腹腔液體量,打開腹腔,將干紗布消毒,稱重后置入腹腔,以吸取未抽凈的腹透液,后再稱取紗布質(zhì)量。 同時(shí)分別留取腹透液標(biāo)本,1500 r/min 離心5 min,留取上清液,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)每組腹膜透析液的葡萄糖濃度,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算超濾量和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量。 超濾量=(紗布吸水后的質(zhì)量-紗布的質(zhì)量)× 1 mL/g+引流量-腹腔注射量；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量(mmol/kg)=(透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液體積)-(透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量)。

1.3.7 大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ含量檢測(cè)

適量腹膜組織進(jìn)行勻漿后,取上清液,采用Luminex200 液相芯片分析儀進(jìn)行VEGF、TNF-α、IL-12、IFN-γ 檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不符合正態(tài)分布的資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,多組比較采用單因素方差分析,以Levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差齊,采用LSD-t法,若方差不齊,采用Games-Howell 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立大鼠尿毒癥模型

尿毒癥組大鼠血清肌酐和尿素氮濃度為正常對(duì)照組的2 ～3 倍,表明大鼠尿毒癥模型造模成功[4-5]。 見表1。

2.2 各組大鼠腹膜組織HE 染色

正常對(duì)照組大鼠腹膜組織較連續(xù)和完整,腹膜間皮細(xì)胞呈扁平狀態(tài),模型組腹膜組織明顯增厚,部分呈柱形,還可見到間皮細(xì)胞的脫落,炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。 扶腎方及塞來昔布干預(yù)后,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腹膜增厚較模型組減輕。 見圖1。

2.3 各組大鼠腹膜功能

腹膜平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與正常對(duì)照組比較,模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組超濾量均明顯下降,模型組、扶腎方低劑量組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較,扶腎方高劑量組超濾量明顯增加,扶腎方高劑量組及塞來昔布組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表2。

2.4 扶腎方對(duì)各組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影響

與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α 表達(dá)上調(diào),IL-12、IFN-γ 的表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。 與模型組比較,扶腎方低劑量組VEGF、TNF-α 表達(dá)下調(diào),IL-12、IFN-γ 表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)；扶腎方高劑量組和塞來昔布組VEGF 表達(dá)下調(diào),IL-12、IFN-γ 表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 見表3。

表1 正常對(duì)照組與尿毒癥組大鼠腎功能比較Table 1 Comparison of renal function between normal control group and uremic group rats

注:A:正常對(duì)照組；B:模型組；C:扶腎方低劑量組；D:扶腎方高劑量組；E:塞來昔布組。圖1 各組大鼠腹膜組織HE 染色Note. A, Control group. B, Model group. C, FSF-L group. D,FSF-H group. E, Cel group.Figure 1 HE staining of peritoneal tissues of rats in each group

表2 各組大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量的變化Table 2 Changes in ultrafiltration volume and glucose transport of rats in each group

3 討論

腹膜透析是終末期腎病患者腎替代治療的主要方式之一,但PD 相關(guān)的腹膜超濾衰竭是長(zhǎng)程PD患者面臨的嚴(yán)峻問題。 其中腹膜血管新生是引起超濾衰竭的重要原因,新生的腹膜血管增加了腹膜毛細(xì)血管交換面積,造成小分子溶質(zhì)高轉(zhuǎn)運(yùn),葡萄糖快速被腹膜吸收,腹腔的滲透濃度梯度快速消失,從而出現(xiàn)腹膜超濾減少,患者體內(nèi)水分和尿毒素不能有效清除,極易出現(xiàn)心臟超負(fù)荷,終致患者退出PD,甚則危及生命。 有研究表明[6],抑制腹膜血管新生,有助于減少腹膜粘連、延緩腹膜纖維化進(jìn)程,其保護(hù)腹膜功能的作用比抑制腹膜纖維化更強(qiáng)。 腹膜血管新生發(fā)生的原因和機(jī)制復(fù)雜,受非生物相容性腹透液和炎癥狀態(tài)等因素影響。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用改善腹透液生物相容性、預(yù)防腹膜炎等手段抑制腹膜血管新生,防治腹膜超濾衰竭。 部分單味及復(fù)方中藥中藥具有抑制腹膜血管新生、抗腹膜纖維化的作用,中醫(yī)藥減輕腹膜血管新生,防治腹膜超濾衰竭備受研究者的關(guān)注。 研究表明,黃芪甲苷、丹參酮、大黃素、腎康注射液等可改善由高糖腹透液誘導(dǎo)的大鼠腹膜功能減退,防治腹膜纖維化[7]。

Hanahan 等[8]在上世紀(jì)九十年代提出了血管生成與血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的表達(dá)有關(guān),也就是有關(guān)血管生成的開關(guān)平衡假說,即血管穩(wěn)態(tài)的維持,需要血管生成促進(jìn)因子和抑制因子的共同調(diào)控,若兩種因子的表達(dá)失衡,就可能誘發(fā)血管新生化,引起病理性的血管新生。 VEGF 是內(nèi)皮細(xì)胞最具特異性的生長(zhǎng)因子,主要功能是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移,是血管新生的標(biāo)志性指標(biāo)[9]。 有研究表明[10],在尿毒癥和高糖腹透液的刺激下,腹膜組織高表達(dá)血管生成促進(jìn)因子VEGF,并和腹膜血管新生程度呈正相關(guān)；應(yīng)用血管生成抑制劑可使VEGF 表達(dá)下調(diào),減輕腹膜血管新生。TNF-α 是由一種活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成和分泌的、最重要的炎癥因子之一。 研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,與VEGF 同樣都具有促進(jìn)血管生成的作用[11-12],IL-12 是由抗原提呈細(xì)胞和B 細(xì)胞產(chǎn)生,是一種異源二聚體形式的前炎癥細(xì)胞因子,并以這種形式分泌到細(xì)胞外。 IL-12 能誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生,在體內(nèi)免疫應(yīng)答中它也是IFN-γ產(chǎn)生所必需。 研究表明,IL-12 與IFN-γ 都具有抑制血管生成的作用,IL-12 與IFN-γ 表達(dá)上調(diào),能夠減少VEGF 的生成,發(fā)揮抑制血管新生的作用[13-14]。塞來昔布是一種環(huán)氧化酶-2 抑制劑,可特異性抑制環(huán)氧化酶-2,減少VEGF 的生成,從而抑制腹膜血管新生,目前在實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用[15-16]。 筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn),扶腎方可通過調(diào)節(jié)尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜組織TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表達(dá)抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT,改善腹膜纖維化及腹膜超濾功能[17]。

本研究采用大鼠5/6 腎切除建立尿毒癥模型后,進(jìn)行腹腔注射腹膜透析液,成功復(fù)制尿毒癥腹膜透析大鼠模型,并觀察了扶腎方對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜組織的形態(tài)學(xué)、腹膜的超濾功能及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能,以及腹膜組織血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子VEGF、TNF-α、IL-12、INF-γ 表達(dá)的影響。 研究顯示,模型組腹膜組織明顯增厚,部分呈柱形,還可見到間皮細(xì)胞的脫落,炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。 扶腎方及塞來昔布干預(yù)后,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腹膜增厚較模型組減輕。 腹膜平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組比較,扶腎方高劑量組超濾量明顯增加,扶腎方高劑量組及塞來昔布組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與正常對(duì)照組比較,尿毒癥腹膜透析模型組大鼠腹膜組織中VEGF、TNF-α 的表達(dá)明顯上調(diào),IL-12、IFN-γ 的表達(dá)明顯下調(diào)；與模型組比較,扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組和塞來昔布組均能下調(diào)VEGF、TNF-α 表達(dá),上調(diào)IL-12、IFN-γ 的表達(dá)。 扶腎方的作用與塞來昔布類似。 筆者推測(cè)在5/6 腎切除大鼠尿毒癥腹膜透析模型中,扶腎方可改善腹膜組織形態(tài)學(xué)變化,并通過下調(diào)腹膜組織中血管生成促進(jìn)因子VEGF、TNF-α的表達(dá),上調(diào)血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表達(dá),達(dá)到改善腹膜功能,防治超濾衰竭的作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,本虛標(biāo)實(shí)為尿毒癥的基本病機(jī),本虛主要為脾腎虧虛,標(biāo)實(shí)表現(xiàn)為濕濁、瘀血,濁、瘀主要由脾腎虧虛導(dǎo)致。 患者行PD 治療后,仍不失尿毒癥病機(jī)關(guān)鍵,故脾腎虧虛、濕濁瘀血內(nèi)蘊(yùn)為PD 相關(guān)腹膜超濾衰竭的主要病機(jī)。 扶腎方是根據(jù)以上病機(jī)關(guān)鍵而組成的臨床效方,由黃芪、當(dāng)歸、陳皮、半夏、淫羊藿、熟軍、丹參、鬼箭羽組成,主要功效為“健脾益腎,化瘀降濁”,組方融中醫(yī)“補(bǔ)、和、消”三法于一體,前期臨床及基礎(chǔ)研究表明,該方能顯著改善尿毒癥PD 大鼠腎功能,延緩PD 腹膜纖維化,改善腹膜超濾衰竭[17-18],但其具體作用機(jī)制尚不明確。

表3 扶腎方對(duì)各組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影響Table 3 Effect of FSF on VEGF, TNF-α, IL-12 and IFN-γ contents in peritoneal tissue of rats in each group

綜上所述,本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí),扶腎方具有減輕尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜損傷、改善腹膜超濾衰竭的作用,該作用可能與下調(diào)腹膜組織血管生成促進(jìn)因子VEGF、TNF-α 的表達(dá),上調(diào)血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表達(dá)有關(guān),但扶腎方調(diào)控腹膜血管新生的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入探索。