王奕丹張 磊王建楠伍慧茹張 玲楊 洋隋汝波*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州 121000； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院,遼寧 錦州 121000)

PSD 是腦卒中后出現(xiàn)的一類情感障礙性疾病,增加了患者的致殘率及死亡率[1-2]。 然而,其發(fā)病機(jī)制尚不明,有多種學(xué)說并存[3],其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說最具代表性。 然而,目前單純補(bǔ)充單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的藥物(如選擇性5-HT 再攝取抑制劑,SSRIs)對PSD 患者療效欠佳,且存在起效慢、毒副作用大、復(fù)發(fā)率高等問題[4],因此為PSD 尋找新的治療藥物勢在必行。

經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn),患有風(fēng)濕類疾病的PSD 患者在應(yīng)用免疫抑制劑后可改善PSD 樣表現(xiàn)。 并且有研究顯示,卒中后激活的免疫炎癥反應(yīng)使吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamo-pituitaryadrenal axis, HPA)過度表達(dá)[5],最終導(dǎo)致單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的耗竭[6]。 因此可以猜測,抗炎可能會提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平,進(jìn)而改善PSD 樣表現(xiàn)。 為此本實(shí)驗(yàn)選用免疫抑制劑FTY720 進(jìn)行干預(yù),采用行為學(xué)、分子學(xué)及基因?qū)W等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)FTY720可改善PSD 大鼠的抑郁行為,提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平。 本研究將為PSD 的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠60 只,雄性,6 ～7 周齡,體重(200 ± 20)g,購自錦州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(遼)2017-0006]。 飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)SPF 動物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(遼)2019-0007]。 動物實(shí)驗(yàn)研究由錦州醫(yī)科大學(xué)審批(IACUC 2019007),按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則予以人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

FTY720 源自美國Sigma 公司,CAS:162359-56-0；鹽酸氟西汀膠囊,禮來(蘇州)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字J20170022；ELISA 檢測試劑盒(美國R&D 公司,5-HT 批號:L190408615,NE 批號:L190501419,DA 批號:L190402208)；酶標(biāo)儀(批號:ELX-800,美國BIOTEK 公 司)； 熒 光 定 量 PCR 儀(批 號:Exicycler 96,韓國BIONEER 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及模型建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后行曠野實(shí)驗(yàn),選取評分相近的60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)和模型組(n=50)。 假手術(shù)組除頸總動脈不插入栓線外,余操作相同。 模型組大鼠參照Zealonga 線栓法[7]制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。 術(shù)后24 h 行Zealonga 神經(jīng)行為學(xué)評分,選取評分1 ～3 分的大鼠入組[7-8]。 將MCAO 模型制備成功的大鼠再隨機(jī)分為卒中組(n=10)、PSD 組(n=10)、FLU 組(n=10)及聯(lián)合治療組(n=10)。 其中PSD 組、FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠在MCAO 術(shù)后第3 天單籠飼養(yǎng)并加以Willner 等[9]和Katz 等[10]方法改良的慢性不可預(yù)知的溫和性刺激(CUMS),包括:①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③潮濕墊料21 h；④45°傾斜鼠籠17 h；⑤行為限制2h；⑥持續(xù)照明17 h；⑦4℃冰浴游泳5 min；⑧水平震蕩鼠籠5 min；⑨夾尾1 min,每日隨機(jī)采取一種刺激方式,持續(xù)28 d。

1.3.2 給藥劑量及方法

治療組于慢性應(yīng)激刺激第1 天時腹腔注射給藥。 FLU 組:鹽酸氟西汀溶液(5 mg/kg),聯(lián)合治療組:鹽酸氟西汀溶液(5 mg/kg)+FTY720(1 mg/kg)。假手術(shù)組、卒中組、PSD 組予等體積去離子水。

1.3.3 行為學(xué)指標(biāo)測定

(1)曠野實(shí)驗(yàn):參照Papp 等方法[11]制黑壁白底80 cm×80 cm×50 cm 無蓋紙箱,底部分為25 個等格,將大鼠置于中央格內(nèi),待大鼠從中央格啟動后記錄,以穿越底面格數(shù)為水平運(yùn)動得分,1 格計1分,以直立次數(shù)為垂直運(yùn)動得分,動物雙足離開底面,無論站立多長時間直至雙足放下計1 分,每次記錄5 min。

(2)蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn):參照Willner 等方法[9],實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練大鼠飲用1%蔗糖水。 大鼠禁食水20 h后,給予1 瓶1%蔗糖水和1 瓶蒸餾水,1 h 后取出,測定大鼠蔗糖水消耗量與總液體消耗量比值。

1.3.4 ELISA 法檢測大鼠海馬中5-HT、NE、DA含量

大鼠于末次行為學(xué)指標(biāo)測定后斷頭取腦,冰上分離海馬組織,放入勻漿器中,加入生理鹽水在冰浴中磨成勻漿液,離心20 min 后取上清。 按ELISA試劑盒說明書操作,測定5-HT、NE、DA 含量。

1.3.5 Real-time PCR 法檢測大鼠海馬中TPH2mRNA、TH mRNA 的表達(dá)

取適量海馬組織根據(jù)試劑盒說明書提取樣本RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 樣本后用TPH、TH 的特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,采用2-△△CT方法進(jìn)行熒光定量分析。 引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進(jìn)行分析。 計量資料符合正態(tài)性分布和方差齊性,不同組別間對比采用方差分析,同時分析時間和組別關(guān)系時采用重復(fù)測量方差分析,兩兩對比采用LSD-t檢驗(yàn),結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠野實(shí)驗(yàn)

(1)水平運(yùn)動得分

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比水平運(yùn)動次數(shù)減少(P＜0.05)。 第15、22、29 天時,與假手術(shù)組、卒中組比,PSD 組大鼠水平運(yùn)動次數(shù)逐漸減少(P＜0.05)；與PSD 組比,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠水平運(yùn)動次數(shù)顯著增加(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表2)。

(2)垂直運(yùn)動得分

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比垂直運(yùn)動次數(shù)減少(P＜0.05)。 第15、22、29 天時,與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠垂直運(yùn)動次數(shù)明顯減少(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠垂直運(yùn)動次數(shù)增加(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見表3)。

(3)中央格停留時間

第1 天時,各組大鼠中央格停留時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 第8、15、22、29 天時,與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠中央格停留時間逐漸延長(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠中央格停留時間縮短(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見表4)。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

表2 各組大鼠水平運(yùn)動得分比較(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

表2 各組大鼠水平運(yùn)動得分比較(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups水平運(yùn)動得分(分)Horizontal movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術(shù)組Sham operation group 45±4.4 50.3±5.79 63.2±6.09 68±4.67 72.1±6.01卒中組Stroke group 39.1±4.77* 48±5.46 60.3±3.77 65.8±5.61 70±5.25 PSD 組PSD group 38±4.32* 35.1±4.82*# 31.8±5.81*# 28.2±5.27*# 25±4.85*#氟西汀組Fluoxetine group 38.2±3.82* 44.8±2.53● 51.9±4.48● 57.7±5.93● 60.9±4.7●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 38.1±4.51* 45.1±2.47● 56.5±3.14●△ 65±5.08●△ 67.1±4.86●△

2.2 蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比蔗糖水消耗比例降低(P＜0.05)。 第8、15、22、29天時,與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠蔗糖水消耗比例明顯下降(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU組與聯(lián)合治療組大鼠蔗糖水消耗比例升高(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表5)。

2.3 海馬中5-HT、NE、DA 含量

與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量顯著降低(P＜0.05)；與PSD組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量升高(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見圖1)。

2.4 海馬中TPH2 mRNA、TH mRNA 表達(dá)

與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠海馬中TPH2 mRNA、TH mRNA 的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中TPH mRNA、TH mRNA 的表達(dá)量均升高(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖2)。

3 討論

PSD 是腦卒中后最常見的情緒障礙,是危害社會和公共衛(wèi)生的嚴(yán)重問題。 然而目前針對PSD 的治療藥物較少且具有局限性,因此為PSD 探索新的治療途徑至關(guān)重要。

表3 各組大鼠垂直運(yùn)動得分比較( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

表3 各組大鼠垂直運(yùn)動得分比較( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups垂直運(yùn)動得分(分)Vertical movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術(shù)組Sham operation group 12.1±3.73 14.1±3.64 16.1±2.92 17±2.79 18.1±3.84卒中組Stroke group 8.5±2.84* 13±3.3 14.9±3.25 15.6±3.1 16.1±2.69 PSD 組PSD group 8±1.94* 7.6±2.55*# 7±2.31*# 6±2.36*# 5.2±1.87*#氟西汀組Fluoxetine group 8.2±1.93* 11.1±1.91● 12±2.58● 12.5±2.59● 13.5±2.64●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 8.1±2.03* 11.3±2.21● 14.5±1.43●△ 15.0±2.31●△ 16.4±3.72●△

表4 各組大鼠中央格停留時間比較( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

表4 各組大鼠中央格停留時間比較( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups中央格停留時間(s)Central grid stay time 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術(shù)組Sham operation group 0.81±0.47 1.02±0.36 1.81±0.4 4.52±0.56 5.5±0.77卒中組Stroke group 0.81±0.42 0.93±0.38 1.93±0.65 5.2±0.58 7±1.06 PSD 組PSD group 0.9±0.37 4.02±0.8*# 7.07±0.89*# 12.18±0.93*# 14.03±1.17*#氟西汀組Fluoxetine group 0.89±0.37 2.4±0.65● 4.5±0.78● 8.82±0.91● 11.05±1.11●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 0.81±0.43 0.95±0.38●△ 2±0.65●△ 5.71±0.82●△ 8.5±0.97●△

表5 各組大鼠蔗糖水消耗比例比較( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

表5 各組大鼠蔗糖水消耗比例比較( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups蔗糖水消耗比例(%)Volume ratio of sucrose water consumption 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術(shù)組Sham operation group 66±13.78 69.6±10.56 75.3±12.53 84.3±15.71 89.7±15.9卒中組Stroke group 53.7±10.14* 63.3±13.38 69.6±12.15 79.5±14.85 83.7±14.24 PSD 組PSD group 52.5±11.94* 46.5±12.43*# 42.6±8.46*# 36.9±8.95*# 31.2±8.85*#氟西汀組Fluoxetine group 51±12.33* 57±10.77● 61.5±11.94● 65.4±14.82● 69±17.49●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 54±13.42* 67.5±5.52●△ 72.3±11.53●△ 78±10.95●△ 82.5±13.87●△

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。圖1 大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 1 Comparison of the content of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。圖2 大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶表達(dá)量比較Note. Compared with the sham operation group, *P ＜0.05. Compared with the stroke group, #P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 2 Comparison of the expression levels of rate-limiting enzymes in the synthesis of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用線栓法制備MCAO 模型的基礎(chǔ)上加用CUMS 法結(jié)合孤養(yǎng)法制備PSD 大鼠模型。 該模型的制備原理是鋸齒類動物經(jīng)過CUMS 應(yīng)激之后出現(xiàn)活動能力下降、興趣喪失、缺乏探索等一系列抑郁樣表現(xiàn)[12-13],較好的模擬了臨床上PSD 的核心癥狀。同時孤養(yǎng)法也模擬了病人患病后住院時的孤獨(dú)狀態(tài),因此該模型在PSD 的相關(guān)研究中廣泛應(yīng)用[14]。

實(shí)驗(yàn)大鼠模型的成功制備是相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)測定的前提。 曠野實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動反映大鼠的運(yùn)動活動性水平；垂直運(yùn)動反映大鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度[15]；中央格停留時間反映大鼠啟動活動的潛伏期[16]；蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)反映了大鼠對獎賞后的快感反應(yīng)[17]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組、卒中組比較,PSD 組大鼠曠野實(shí)驗(yàn)得分及蔗糖水消耗比例明顯下降,提示PSD 模型造模成功。 與PSD 組比較,FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠行為學(xué)得分升高,二者進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組療效更顯著,證實(shí)FTY720可明顯改善PSD 大鼠的抑郁樣行為。 目前免疫抑制劑在治療PSD 方面的研究較少,有少量報道顯示FTY720 可以改善單純抑郁樣行為[18],PSD 作為一種特殊的抑郁類型,本實(shí)驗(yàn)已證實(shí)FTY720 對PSD同樣具有確切的療效,為PSD 的治療提供新思路。

前文已證實(shí)FTY720 對PSD 大鼠的抑郁樣行為具有改善作用,本研究的另一核心是進(jìn)一步觀察這種改善作用是否與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),PSD 組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 含量明顯降低,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA的含量升高,進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量升高更顯著, 證實(shí)FTY720 對PSD 大鼠行為學(xué)的改善作用是通過提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平實(shí)現(xiàn)的。 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類具有廣泛生物學(xué)活性的物質(zhì),其中5-HT、NE、DA 與抑郁癥關(guān)系最為密切。 目前有理論研究表明,卒中后中樞及外周發(fā)生的炎癥反應(yīng)將繼發(fā)一系列改變[19-20],不僅過度激活I(lǐng)DO 酶,導(dǎo)致色氨酸(5-HT 的前體)被降解,分解成的喹啉酸及犬尿酸抑制DA 的釋放[21],而且會過度激活HPA 軸,使皮質(zhì)醇過量分泌[5,22],進(jìn)一步誘導(dǎo)降解酪氨酸(NE 的前體)[23]。 由此可見單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少的根源在于炎癥反應(yīng)的激活,本次研究也通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗炎后可以提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量,為上述理論研究提供了可行性。

為了進(jìn)一步探究FTY720 提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的機(jī)制,本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)FTY720 可以調(diào)控單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶的表達(dá)。 結(jié)果提示,PSD組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達(dá)量顯著下降,與PSD 組比較,FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達(dá)量升高,二者進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),聯(lián)合治療組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達(dá)升高更顯著。 TPH2 與TH 屬芳香族氨基酸羥化酶家族,分別負(fù)責(zé)5-HT 及兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)(NE、DA)合成的最初步驟[24],是催化5-HT、NE、DA 合成的限速酶。 目前國內(nèi)在FTY720 對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶表達(dá)方面的作用尚無報道,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FTY720 在調(diào)控單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶表達(dá)方面的有效性,進(jìn)而也證實(shí)了FTY720 可通過此途徑來提升單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平。

綜上所述,FTY720 對PSD 大鼠的抑郁樣行為具有明顯改善作用,其作用機(jī)制為通過調(diào)控海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶的表達(dá)來提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平,進(jìn)而改達(dá)到治療效果。 本次研究不僅為PSD 的治療提供了新的方向,也為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說提供了重要的補(bǔ)充。