付信靖張 鈺郭建國張 玲秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

伴隨著現(xiàn)代社會的工業(yè)化進程的加速,空氣污染日益嚴重,已成為當(dāng)代的一個全球化問題[1]。 空氣污染物由若干種組分組成,其中包括細顆粒物(PM 2.5)、超細顆粒物(UFPM)、毒性氣體、有機化合物和金屬顆粒等,其重要來源是與交通相關(guān)的空氣污染物,主要是柴油機廢氣(DE)[2]。 細顆粒物又稱細粒、細顆粒、PM2.5(particulate matter 2.5,PM 2.5),指環(huán)境空氣中空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于2.5 μm 的顆粒物。 它能較長時間懸浮于空氣中,其在空氣中含量濃度越高,就代表空氣污染越嚴重。 隨著研究進展,細顆粒物PM2.5 對人體健康的影響也日益凸顯[3]。

PM2.5 對人體的危害首先表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)。除呼吸系統(tǒng)外,空氣中的細顆粒物PM2.5 吸入后對其他器官和系統(tǒng)產(chǎn)生負面作用,如心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等[4]。 大規(guī)模的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),空氣污染組分細顆粒物(PM)對人類認知功能產(chǎn)生負面影響。 近來公認的一種機制是PM2.5 可以直接損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng),同時污染物引起呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有害因子,通過外周循環(huán)到達大腦,導(dǎo)致大腦的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激等反應(yīng),損傷神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)和功能。

本項目對PM2.5 呼吸暴露的病理生理機制理論進行更深層次的探索,探究空氣中細顆粒物PM2.5 對小鼠認知功能的影響,及發(fā)生病理改變的分子機制。 有研究提示,PM2.5 暴露可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生認知癥狀,而具體機制尚不明確[5]。 本研究是宏觀環(huán)境因素與微觀分子機制相結(jié)合的機制探索研究,有助于加深環(huán)境因素、空氣污染影響人體健康的具體分子機制的理解,為環(huán)境與健康的相關(guān)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選用8 周齡雌性C57BL/6 小鼠12 只,購于南京模式生物研究所[SCXK(蘇)2018-0008],體重(21±2)g。 所有小鼠均為SPF 級,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心南院屏障環(huán)境中[SYXK(京)-2018-009]。 環(huán)境溫度24℃～26℃,光照14 h,黑暗10 h,小鼠均自由飲水取食。 本實驗中動物的使用已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(zhǔn)(ILAS-QC-2017-002)。 本次實驗所有的動物實驗操作過程嚴格按照實驗動物使用的3R 原則和倫理的相關(guān)規(guī)定進行。

1.2 主要試劑與儀器

狹縫分離式PM2.5 在線濃縮富集系統(tǒng)購自北京慧榮和科技有限公司；行為學(xué)設(shè)備為Ethovision XT 軟件監(jiān)測系統(tǒng),購自荷蘭Noldus 公司；HE 以及免疫組化染色試劑盒,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp I Panel 23-plex 試劑盒購自美國Bio-Rad 公司；磷酸緩沖鹽(PBS)購自美國Gibco 公司；Iba-1(貨號ab178847)購自美國Abcam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠的空氣細顆粒物PM2.5 暴露模型的建立

本實驗選取8 周齡C57BL/6 雌性小鼠共12只,隨機分為2 組,每組6 只,分別進行含有高濃度的細顆粒物PM2.5 的空氣暴露或?qū)φ战M屏障環(huán)境內(nèi)的清潔空氣的暴露。 暴露時間為2018 年北京冬春季,于PM2.5 污染較嚴重時,將室外空氣經(jīng)PM2.5 在線濃縮富集系統(tǒng)進行實時收集、濃縮富集,細顆粒物富集至濃度100 ～800 μg/m3。 小鼠置于PM2.5 在線濃縮富集系統(tǒng)內(nèi)自由活動,每日固定暴露4 h,每周暴露5 d,共持續(xù)15 周。

1.3.2 小鼠新物體識別實驗

新物體識別實驗(novel object recognition test)是一種評價認知功能的實驗方法,主要被用于評價認知和短期記憶功能等。 實驗箱為長50 cm、寬50cm、高30 cm 的區(qū)域,四周均不透明。 實驗室保持安靜,室內(nèi)溫度保持恒定,光線保持均勻。 每次每只小鼠實驗前后均用75%乙醇噴灑、擦拭實驗箱和實驗用積木,防止每只動物之間氣味干擾。

新物體識別實驗過程共2 d,分為第1 天適應(yīng)期(blank):動物對行為箱適應(yīng)5 min,第2 天熟悉期(sample)和測試期(test),熟悉期將兩塊相同的紅色圓柱體積木(直徑3 cm)分別放在盒子內(nèi)左右兩側(cè),距離箱體側(cè)壁8 cm,小鼠自由嗅探積木5 min。 1 h后為測試期:將箱內(nèi)一個物體換成藍色正方體積木(邊長3 cm),位置不變,將小鼠放入箱內(nèi)同一位置,記錄小鼠在5 min 內(nèi)對新舊兩個不同實驗積木的探索時間,即TN(time of new object)和TF(time of familiar object )。 實驗結(jié)果以識別指數(shù)(discrimination index, DI)表示,計算公式為:DI=(TN-TF/TN+TF)×100%[6-7]。

1.3.3 病理學(xué)檢測

將小鼠進行病理取材,各器官于福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋,切取厚度為5 μm 的石蠟切片,常溫保存并用于病理學(xué)檢測,分別進行HE 染色或DAB 染色等。 隨后用NanoZoomer Digital Pathology Image 軟件獲取圖像,Image J 分析陽性區(qū)域面積和陽性斑塊數(shù)目。

1.3.4 炎性多因子檢測

炎性多因子檢測是利用Luminex 懸浮芯片技術(shù)進行多個細胞炎性因子檢測的方法,也稱為液相芯片技術(shù)。 它是一種基于xMAP(flexible multi analyte profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺,它在不同熒光編碼的微球上進行抗原抗體、酶底物、配體受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng),通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的。 一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多種不同的生物學(xué)反應(yīng)。 本實驗使用腦組織裂解液上清制備樣品,經(jīng)過樣品孵育、 抗體顯色等步驟, 通過Luminex200 檢測取得數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠的空氣細顆粒物PM2.5 暴露模型驗證

實驗動物隨機為2 組,各組n=6,分別命名為C57BL/6+PM2.5(eC57,后文簡稱為“暴露組”),C57BL/6+CONTROL(C57,后文簡稱為“對照組”)。各組小鼠造模成功后,檢測行為學(xué)癥狀、病理學(xué)表征、以及相關(guān)分子機制研究(圖1)。

為了驗證PM2. 5 暴露或清潔空氣暴露是否可以引起小鼠肺的病理變化,我們對各組小鼠進行了肺取材和病理檢測。 小鼠肺HE 染色發(fā)現(xiàn),吸入PM2. 5 空氣后,暴露組小鼠與清潔空氣對照組相比,肺可見明顯的病理結(jié)構(gòu)改變,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增寬,大量炎性細胞局部浸潤(圖2)。 結(jié)果提示,PM2. 5 的暴露濃度和時長適量,成功建立了小鼠的PM2. 5 暴露模型,引起了肺部病變。

2.2 小鼠空氣細顆粒物PM2.5 暴露后工作記憶能力下降

為了檢測小鼠進行PM2.5 空氣暴露后,是否出現(xiàn)認知行為改變,我們進行了小鼠的認知能力檢測,以新物體識別實驗檢測小鼠的認知能力和工作記憶能力,暴露后進行行為學(xué)實驗時小鼠大約為6月齡。 結(jié)果表明,C57 小鼠PM2.5 暴露后出現(xiàn)明顯的工作記憶能力下降(圖3)。 新物體識別實驗利用小鼠對新物體的天然偏好, 以鑒別指數(shù)(dscrimination index)為指標(biāo),檢測小鼠的工作記憶,若認知和短期記憶能力受損,則無法區(qū)分實驗中哪個物塊為新物體,結(jié)果表現(xiàn)為暴露組小鼠出現(xiàn)新物體識別能力降低、鑒別指數(shù)降低。 對照組(37.93±3.143),暴露組(20.57±5.098),P=0.0159。

2.3 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞激活

為了進一步研究PM2.5 暴露導(dǎo)致小鼠認知受損的機制,我們對各組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)進行了Iba-1 免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果顯示C57BL/6 小鼠在PM2.5 暴露后出現(xiàn)了海馬部位Iba-1 的表達增加,提示PM2.5 暴露后小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的激活(圖4)。 對各組小鼠海馬的Iba-1 表達進行統(tǒng)計分析,C57BL/6 小鼠在PM2.5 暴露后均出現(xiàn)Iba-1 表達的顯著增加(圖5),對照組(0.1533±0.01856),暴露組(0.5033±0.04096),P=0.0015。 這一結(jié)果提示,C57BL/6 小鼠暴露PM2.5 后的認知受損可能由神經(jīng)系統(tǒng)局部炎癥增加造成。

2.4 小鼠中樞系統(tǒng)海馬炎癥因子含量增加

為進一步確認各組小鼠進行空氣暴露后是否出現(xiàn)炎癥反應(yīng),我們對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)取材進行炎癥因子檢測,采用炎性多因子檢測芯片,測定腦組織樣品的炎癥因子濃度。 結(jié)果表明,暴露PM2.5后,小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥因子IL-6 的增加(圖6)。 對照組0.9467±0.08950,暴露組1.263±0.04807,P=0.0356。 這一結(jié)果與小膠質(zhì)細胞結(jié)果一致,提示C57BL/6 小鼠暴露PM2.5 后的認知受損可能由神經(jīng)系統(tǒng)局部炎癥增加造成。

注:小鼠分組進行空氣暴露后依次進行行為學(xué)檢測、病理取材,分別進行病理學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等。圖1 實驗流程示意圖Note. After air exposure, the mice in each group were subjected to behavioral tests, pathological sampling, pathological tests and molecular biological tests, respectively.Figure 1 Schematic diagram of experimental design

注:在新物體識別實驗中,暴露組較對照組小鼠的新物體識別指數(shù)顯著降低,即暴露組小鼠探索新物體的時間顯著縮短。 對照組與暴露組相比,*P＜0.05。圖3 新物體識別實驗各組小鼠暴露后認知能力下降(n=6)Note. In the new object recognition experiment,the discrimination index of PM2.5 group was significantly lower than that in the Control group. The time of mice’ s exploring new object in exposure group was significantly shortened. Control group compared with PM2.5 group, *P＜0.05.Figure 3 Cognitive decline in new object recognition experiment after PM2.5 exposure

2.5 PM2.5 暴露未造成小鼠其他主要臟器損傷

為了排除PM2.5 暴露模型對小鼠認知功能產(chǎn)生影響不是由其他組織器官的病理損傷引起,我們對各組動物主要臟器進行病理學(xué)切片檢測。 結(jié)果表明,PM2.5 暴露對小鼠肝、心臟、腎和大腦的組織結(jié)構(gòu)均未造成明顯病理損傷。 提示PM2.5 對認知的調(diào)控作用并非由其他組織器官損傷造成(圖7)。

注:小鼠肺HE 染色結(jié)果表明,PM2.5 暴露組小鼠與對照組相比可見肺泡隔增寬,炎性細胞浸潤,提示肺部病理改變,PM2.5暴露小鼠造模成功。圖2 造模后小鼠出現(xiàn)肺部的病理改變Note. The results of lung HE staining in mice showed that compared with the control group, alveolar septal were broaden and inflammatory cells were infiltrated in the PM2.5 group, suggesting significant pathological changes in lung. Model of PM2.5 exposure mice was successfully built up.Figure 2 Pulmonary pathological changes in mice after modeling

注:各組小鼠海馬Iba-1 免疫組化染色可見PM2.5 暴露組小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬腦區(qū)出現(xiàn)Iba1 表達增加,小膠質(zhì)細胞激活。圖4 PM2.5 暴露增加小鼠海馬小膠質(zhì)細胞激活(n=3)Note. Immunohistochemical staining in the hippocampus of mice in each group showed increased Iba-1 expression (microglia activation) in the hippocampus of the central nervous system after PM2.5 exposure.Figure 4 PM2.5 exposure increased the activation of hippocampal microglia cells in mice

3 討論

目前已有多項研究證實,空氣污染與多種類型的認知功能呈負相關(guān)關(guān)系[8]。 已有報道PM2.5 暴露后,PM2.5 顆粒上附著的金屬顆?？蓪C體造成持續(xù)性傷害,在包括腦組織的眾多組織中均發(fā)現(xiàn)了金屬顆粒沉積[9]。 越來越多證據(jù)提示暴露在金屬顆粒中,可對生長期的動物產(chǎn)生神經(jīng)毒害作用,并可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥[10]。 我們采用的PM2.5 濃縮富集系統(tǒng)可保留大氣中PM2.5 顆粒上附著的有害物質(zhì),真實地模擬動物在高濃度PM2.5 天氣下暴露狀態(tài)。 通過高濃度PM2.5 暴露小鼠15 周,實驗結(jié)束后我們發(fā)現(xiàn)暴露后的小鼠肺泡隔增寬、炎性細胞浸潤,表明小鼠PM2.5暴露模型建立成功,為后續(xù)研究創(chuàng)造了基礎(chǔ)。

注:對各組小鼠海馬區(qū)域Iba-1 表達進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,暴露組與對照組相比出現(xiàn)海馬腦區(qū)明顯的Iba-1 表達增加。 對照組與暴露組相比,**P＜0.005。圖5 PM2.5 暴露導(dǎo)致小鼠海馬Iba-1 表達增加(n=3)Note. Statistical analysis of Iba-1 expression in the hippocampal region of mice in each group showed that the PM2.5 group had significantly increased Iba-1 expression in the hippocampal region compared with the control group. Control group compared with PM2.5 group, **P＜0.005.Figure 5 Increased expression of Iba-1 in hippocampus of mice caused by PM2.5 exposure

注:對各組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)樣品的IL-6 含量進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,暴露組與對照組相比出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)明顯的IL-6 含量增加。 對照組與暴露組相比,P＜0.05。圖6 PM2.5 暴露導(dǎo)致腦內(nèi)炎癥因子IL-6 含量增加(n=3)Note. Statistical analysis of IL-6 expression in mice brain in each group showed that the PM2.5 group had significantly increased IL-6 expression in mice brain. Control group compared with PM2.5 group,*P＜0.05.Figure 6 Increased expression of IL-6 in mice brain caused by PM2.5 exposure

注:對小鼠除肺外的其他主要臟器進行HE 染色和病理學(xué)分析,結(jié)果表明各組小鼠肝、心臟、腎以及大腦組織,細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)規(guī)則、完整,提示各個重要組織器官病理學(xué)未見明顯異常。圖7 各組小鼠PM2.5 暴露后肝、心臟、腎及大腦組織未見異常(n=3)Note. HE staining and pathological analysis were carried out on other major organs of mice. The results showed that the morphology and structure of liver, heart, kidney and brain tissues of mice in each group were regular and complete, suggesting no obvious pathological abnormalities in each important tissue and organ.Figure 7 No pathological abnormalities were observed in the liver, heart, kidney and brain tissues of mice exposed to PM2.5

PM2.5 影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制可能是由于PM2.5 活化小膠質(zhì)細胞,產(chǎn)生神經(jīng)炎癥,從而損傷神經(jīng)元和突觸功能[11]。 PM2.5 通過鼻部嗅球粘膜遷移或經(jīng)攝取后進入循環(huán)系統(tǒng)的遷移,已通過工業(yè)納米顆粒在嚙齒類實驗動物的實驗研究中得以證實[12]。 嚙齒類動物暴露于高濃度PM2.5 和柴油發(fā)動機尾氣中,大腦中觀察到了嚴重的炎癥反應(yīng)[13]。小膠質(zhì)細胞暴露于PM2.5 后出現(xiàn)形態(tài)變化,表明小膠質(zhì)可能參與PM2.5 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[14]。 體外實驗表明,PM2.5 以劑量依賴方式的降低神經(jīng)元細胞生存率,導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元損傷[15]。此外,經(jīng)PM2.5 刺激的小膠質(zhì)細胞可釋放更多的促炎性細胞因子,如IL-1β 和TNF-α[16]。 而TNF-α 作為一種關(guān)鍵的促炎性細胞因子,已被認為可導(dǎo)致軸突變性,影響神經(jīng)突觸的形成[17]。 也有研究證明,PM2.5 暴露誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活可被吡格列酮等抗炎藥抑制[18]。 這表示小膠質(zhì)細胞在作為PM2.5 誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的中介上起到了關(guān)鍵作用。在我們的實驗中,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬的小膠質(zhì)細胞進行免疫組織化學(xué)染色和分析,也發(fā)現(xiàn)小鼠可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞激活,誘發(fā)了神經(jīng)炎癥狀態(tài)。

綜上所述,本研究對小鼠成功建立了PM2.5 暴露模型,結(jié)合動物行為學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)等方法,初步探究了空氣細顆粒物PM2.5 引起小鼠的認知癥狀的神經(jīng)炎癥機制,為后續(xù)的PM2.5 對健康的危害研究提供參考。